Etude des mécanismes d'action précoces de la leucocidine de Panton et Valentine et développement d'inhibiteurs des leucotoxines de staphylococcus aureus

Les leucotoxines sont des facteurs de virulence majeurs sécrétés par la bactérie Staphylococcus aureus. Ces toxines formant des pores sont constituées de l association de 2 protéines (S + F) qui s oligomérisent en octamères sur les membranes des leucocytes, puis se reconfigurent en un pore transmembranaire sélectif des cations monovalents, et finalement conduit à la lyse de la cellule. Des substitutions en Alanine par mutagénèse dirigée ont permis de caractériser un cluster d acides aminés essentiels pour la fixation de LukS-PV, localisé sur 2 boucles du domaine Rim. Nous avons également apporté de nouveaux éléments sur les voies de signalisation impliquées dans l augmentation de la concentration intracellulaire en Ca2+ provoquée par les leucotoxines. Une pharmacologie des canaux calciques a montré une implication des récepteurs de l IP3 et des Store Operated Channels (SOCs). Les para-sulfonato-calix[n]arènes (SCn) neutralisent la lyse des neutrophiles avec des IC50 2 50 M. Les SCn empêchent la fixation de toutes les leucotoxines aux cellules ciblés, en formant des complexes 1:1 avec les protéines de classe S. Les SCn ont également montré leur efficacité dans un modèle d endophtalmie chez le lapin. Les anticorps à chaine lourde humanisés (HCAbs) anti-LPV ont également montré leur capacité à inhiber la fixation de LukS-PV et/ou LukF-PV aux membranes des cellules, empêchant ainsi leur activation et leur lyse. Le même modèle in vivo a montré que les HCAbs inhibent la réponse inflammatoire et la destruction des tissus.Leucotoxins are major virulence factors secreted by the bacteria Staphylococcus aureus. These pore forming toxins are formed by the association of 2 b-stranded proteins (class S and class F). Bi-partite leucotoxins oligomerize into hetero-octamers on leukocytes membranes, leading to cell activation and degranulation. Then they reconfigure into a monovalent cation selective transmembrane pore, and finally cause cell lysis.Alanine-scanning mutagenesis (19 mutants) allowed the characterization of a cluster of amino acids localized on two loops of the Rim domain essential for LukS-PV binding. We also aimed to characterize the pathways involved in intracellular Ca2+ concentration increase following leucotoxin addition onto neutrophils. Pharmacological targeting of calcium channels showed that IP3 receptors and Store Operated Channels (SOCs) were involved. These results illustrate that leucotoxins have complex direct and indirect impacts on immune system, that their mode of action is much more than simply forming pores.Para-sulfonato-calix[n]arenes (SCn) have IC50 values between 6 22 M for neutrophil lysis inhibition. They form 1:1 complex with class S proteins of all leucotoxins, which prevent further binding to cell membrane. The inhibitory properties of SCn were also observed in vivo in a toxin-induced rabbit endophthalmitis model. Anti-PVL Humanized Heavy Chain only Antibodies (HCAb) also prevent binding to cell membranes, and thus pore formation. The same in vivo model showed that HCAbs inhibit inflammatory reactions and tissue destruction.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF