Rôle de la protéine VIF du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) dans le métabolisme d'APOBEC3G (fixation à l'ARNm et inhibition traductionnelle)

La protéine Vif du VIH-1 est une petite protéine auxiliaire de 23 kDa, hautement basique et essentielle à la pathogénie dans les cellules non-permissives (cellules naturelles de l infection par le VIH-1). Très récemment, il a été montré que ces cellules expriment spécifiquement un facteur de restriction, APOBEC3G (A3G) qui, en absence de Vif, induit une baisse de l infectivité virale. Cependant, le virus a développé une stratégie qui lui permet de contourner cette défense immunitaire. Ce mécanisme d évasion est contrôlé par la protéine Vif qui agit de multiples façons pour contrecarrer A3G : au niveau de l encapsidation en inhibant son incorporation dans les virions, au niveau post-traductionnel en induisant sa dégradation par la voie de l ubiquitine/protéasome et enfin au niveau traductionnel par un mécanisme encore inconnu. Mon travail de thèse a consisté en l étude de ce dernier volet. Tout d abord, nous avons montré que Vif se fixe à l ARNm d A3G et présente une meilleure affinité pour la région 3 UTR que pour la 5 UTR. Ces résultats sont confirmés par des analyses de cartographie en solution et d empreinte qui indiquent que Vif se fixe majoritairement sur la région 3 UTR. L analyse d un mutant du domaine de multimérisation (PPLP) de Vif (Vif AALA) suggère que ce motif est impliqué dans la spécificité d interaction avec l ARNm d A3G, Vif AALA ne présentant plus aucune préférence de liaison pour les ARN testés. Ensuite, des études biochimiques et biophysiques nous ont permis de caractériser les protéines Vif sauvage (Vif WT) et Vif AALA. Nos résultats indiquent que la protéine Vif WT s assemble en complexes de 6 à 10 protéines alors que la protéine Vif AALA semble s associer en dimères ou en trimères. La mutation du domaine PPLP réduit donc fortement la capacité de Vif à multimériser. L analyse de la structure secondaire indique que les deux protéines s organisent de façon similaire et que la région C-terminale est principalement déstructurée. Ce manque d organisation expliquerait en partie la plasticité de cette région, autorisant ainsi une plus grande diversité d interaction de la protéine Vif avec ses nombreux partenaires. Dans le but d étudier les éventuelles conséquences de la fixation de Vif à l ARNm d A3G, nous avons analysé la traduction d A3G ex vivo en présence de Vif. Nous avons montré que la région 5 UTR est nécessaire à l inhibition traductionnelle par Vif mais que le domaine de multimérisation n intervient pas dans ce mécanisme. Ainsi, compte tenu des propriétés de fixation de Vif à l ARNm d A3G, ces résultats suggèrent que l affinité de Vif pour un ARN ne reflète pas obligatoirement son importance dans l inhibition traductionnelle. L étude du mécanisme d inhibition lui-même suggère que Vif stimule l assemblage de l ARNm en complexes de haute densité. Des expériences complémentaires seront nécessaires afin d identifier les composants de ces complexes et de localiser cet assemblage dans la cellule.HIV-1 Vif protein is a little auxiliary protein of 23kDa, highly basic and essential to pathogenicity in non-permissive cells. Recently, it has been shown that these cells express specifically a restriction factor, APOBEC3G (A3G) which, in absence of Vif, induced a decreased in viral infectivity. However, the virus has developed a strategy which allows to by-pass this immunitary defense. This evasion mechanism is controlled by Vif protein which acts by various ways to counteract A3G: at the packaging level by inhibiting its incorporation in the viral particles, at post-translational level by inducing its degradation and finally at translational level by understood mechanism. My PhD work focused in this last aspect. First of all, we have shown that Vif binds to A3G mRNA and presents a better affinity for 3 UTR than for 5 UTR. These results are confirmed by in solution probing and footprinting experiments which suggest that Vif binds preferentially the 3 UTR. Analyses of a Vif mutant in the multimerization domain (AALA Vif) show that this motif is implicated in binding specificity to A3G mRNA because this protein didn t show anymore any binding preference for all tested RNA. Then, biophysical and biochemical studies allow us to characterize the wild-type Vif (WT Vif) and AALA Vif. Our results show that WT Vif is organized in complexes of 6-10 proteins whereas AALA Vif seems to form only dimers or trimers. Consequently, mutation in the multimerization domain decreased the Vif capacity to multimerize. Analyses of secondary structure indicate that the two proteins are organized in a similar way and that the C-terminal region is as a majority unstructured. This lack of organization would explain the plasticity of this region, providing a greater diversity of interactions between Vif and its numerous partners. In order to study the potential consequences of Vif binding to A3G mRNA, we analyzed the A3G translation in vitro and ex vivo in presence of Vif. We showed that the 5 UTR of A3G mRNA is necessary to translational inhibition by Vif but that the multimerization domain is not implicated in this mechanism. So, considering the Vif binding proprieties to A3G mRNA, these results suggest that Vif affinity for RNA doesn t necessarily correlate with its importance in translational inhibition. The study of the inhibition mechanism itself suggests that Vif stimulates the assembly of A3G mRNA in complexes of high molecular weight. Complementary experiments will be necessary to identify the components of these complexes and to localized these assemblies in the cell.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF