Ingénierie des xylanases de Penicillium funiculosum IMI 378536 (amélioration de la robustesse de l'activité xylanolytique dans la préparation commerciale Rovabio Excel )

Le Rovabio Excel est un cocktail enzymatique complexe sécrété par le champignon filamenteux Penicillium funiculosum. La société ADISSEO commercialise cet additif alimentaire destiné à la nutrition animale car les principales enzymes qui le constituent dégradent les polymères contenus dans les céréales, tels que les polysaccharides non amylacés. Ainsi, le Rovabio Excel permet d améliorer la digestibilité et d augmenter la valeur nutritionnelle des matières premières agricoles en réduisant la viscosité du bol alimentaire des animaux. Dans le but d augmenter sa compétitivité, ADISSEO a fait conduire des études sur cette solution pour la caractériser biochimiquement et optimiser son potentiel xylanolytique.Ces travaux de thèse s inscrivent dans ces projets industriels et ont poursuivi deux objectifs distincts. Le premier correspondait à l augmentation de la thermostabilité de la protéine XynB du Rovabio Excel , pour lui permettre de résister à la granulation. Le second concernait XynA, la protéine majoritaire de la solution multienzymatique, qui a été caractérisée biochimiquement. Les premiers résultats de caractérisation biochimique de XynA ont montré que la protéine était 100 fois plus active sur b-1,4-glucane que sur xylane. Des tests complémentaires sur pNP-cellobiose et pNP-b-D-Lactopyranose ont révélé que XynA était 5,2 fois plus active sur pNP-cellobiose et possédait une activité exo . Enfin, l analyse des produits d hydrolyse d oligosaccharides composés de 2 à 5 unités de glucose a confirmé que la protéine XynA était une cellobiohydrolase de type I, très sensible à l inhibition par le cellobiose (IC50 - C2 = 17,7 M). L étude la thermostabilité de XynB a confirmé que cette protéine n était pas naturellement thermostable. Les résultats des travaux d ingénierie avec l ajout d un pont disulfure pour rigidifier la structure 3D de la protéine n ont pas été probants. En revanche, la création de protéines chimères à partir de protéines plus thermostables (TfxA de Thermomonospora fusca et XynII de Trichoderma reesei) a permis d améliorer la stabilité thermodynamique de XynB avec des Tm augmentés de plus de 10CThe Rovabio Excel is a complex enzymatic cocktail secreted by the filamentous fungus Penicillium funiculosum. The ADISSEO company sells it as food additive for animal feed because the main enzymes degrade polymers contained in grains, such as non-starch polysaccharides. Thus, the Rovabio Excel improves the digestibility and increases the nutritional value of agricultural raw materials by reducing the viscosity of the diet of animals. In order to increase its competitiveness, ADISSEO did conduct studies on this solution to characterize it biochemically and maximize its xylanolytic potential.This thesis takes part of this industrial project and have pursued two distinct objectives. The first corresponds to the increase in the thermostability of the protein XynB from the Rovabio Excel , to enable it to resist at the granulation process. The second was XynA, the major protein of the multienzyme solution, which was characterized biochemically.Initial results of biochemical characterization of XynA showed that the protein was 100 times more active on b-1,4-glucan on xylan. Additional tests on pNP-cellobiose and pNP-b-D-Lactopyranose revealed that XynA was 5.2 times more active on pNP-cellobiose and possess an "exo-acting" activity. Finally, the analysis of products from oligosaccharides hydrolysis, composed of 2 to 5 units of glucose, confirmed that the protein XynA was a type I cellobiohydrolase, very sensitive to inhibition by cellobiose (IC50-C2 = 17.7 M).The thermostability of XynB study has confirmed that this protein was not thermostable naturally. The results of the engineering work with the addition of a disulfide bridge to rigidify the 3D structure of the protein were not conclusive. However, the creation of chimeric proteins with more thermostable proteins (TfxA from Thermomonospora fusca and XynII from Trichoderma reesei) has improved the thermodynamic stability of XynB with Tm increased by more than 10CTOULOUSE-INSA-Bib. electronique (315559905) / SudocSudocFranceF