Cellules souches pluripotentes humaines dans La condition in vitro (différentiation et instabilité génomique)

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) sont des cellules capables à la fois d'autorenouvellement et de se différencier en tous les types cellulaires. Elles peuvent être issues de l'embryon (pour cellules souches embryonnaires humaines, hESC) ou être obtenues par reprogrammation d'une cellule différenciée (pour cellules souches pluripotentes induites humaines, hiPSC). Les hPSC sont au centre d'enjeux scientifiques, médicaux et économiques majeurs, en particulier dans le cadre des maladies génétiques et orphelines. En effet, elles ouvrent la porte à de nouvelles stratégies de modélisation de maladies génétiques humaines in vitro et sont une source potentiellement illimitée de cellules pour une thérapie cellulaire des maladies dégénératives. Cependant, la culture in vitro de hPSC est une étape essentielle avant toute application clinique ou recherche fondamentale. En effet, la culture cellulaire est nécessaire pour l'amplification du nombre des cellules, et est nécessaire pour toute étape de différenciation in vitro. Or c'est une étape délicate pour le succès des applications visées. Mon travail de doctorat s'est focalisé sur deux aspects de la culture des hPSC. Dans un premier temps, j'ai modélisé in vitro une voie de différenciation, le développement trophoblastique humain, en modulant les paramètres de la condition de culture, notamment en jouant sur la concentration du facteur de croissance BMP4. Ce travail m'a permis d'élucider la toute première bifurcation de différenciation cellulaire au cours du développement embryonnaire humain précoce. Dans un second temps, mon travail s'est focalisé sur le changement phénotypique et génomique des hPSC au cours de la culture in vitro. J'ai montré que l'utilisation de certains protocoles de passage cellulaire en particulier le passage par dissociation cellulaire complète par utilisation de trypsine - se traduit par des acquisitions très précoces d'anomalies génétiques chromosomiques et sub-chromosomiques, et que des anomalies sub-chromosomiques pouvaient précéder l'apparition d'anomalies chromosomiques. Les conséquences de ces observations sont importante pour la recherche de la culture de hPSC : (1) il faut définitivement renoncer à l'utilisation des passages par dissociation cellulaire complète, y compris pour les méthodes de culture en suspension, et (2) il faut, pour valider une technique de culture, compléter systématiquement le caryotype par un examen d'analyse génétique avec une meilleure résolution.Human pluripotent stem cells (hPSC) are the stem cells capable to self-renew and also to differentiate into all the cell types. These cells can be derived from embryos (for human embryonic stem cells, hESC) but also be obtained by reprogramming the differentiated somatic cells (for human induced pluripotent cells, hiPSC). The hPSC become central stakes of science, medicine and economy, particularly for genetic and rare diseases. In fact, they open up the new perspectives to the novel treatment strategies by remodeling human genetic diseases in vitro and at the same time they are a potentially unlimited cell source for cell therapy for especially degenerative diseases. Meanwhile, the hPSC in vitro culture is one of the most important steps before passing to the clinic applications and in fundamental research, as the proliferation and pluripotency can only be maintained in culture condition as well as many differentiation methods. My PhD work was concentrated on the hPSC in vitro culture. At first, I modeled human trophoblastic development and its differentiation pathway in vitro by modulating the parameters of culture, especially the concentration of BMP4. This work permitted clarifying the first cell lineage bifurcation in early human embryonic development. Secondly, my word was focalized on the phenotypic and genomic changes of hPSC during the in vitro culture. I demonstrated that the use of some passaging protocols in culture, particularly complete cell dissociation by trypsin, was translated by very early acquisitions of chromosomal and sub-chromosomal abnormalities, and that the appearance of sub-chromosomal abnormalities could precede chromosomal abnormalities. The consequences of these observations are important for the hPSC culture research: (1) the use of complete cell-dissociation passaging should be definitively abandoned, including the suspension culture, and (2) the genetic analyses with higher resolution should be added to validate a culture technic.MONTPELLIER-BU Médecine UPM (341722108) / SudocSudocFranceF