Caractérisation de nouvelles fonctions pour EGFR dans le carcinome hépatocellulaire (résistance au sorafenib et régulation de l expression de l isoforme a du récepteur de l insuline)

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est un cancer de mauvais pronostic. Il se classe au 6ème rang mondial en terme de prévalence et au 3ème rang en terme de mortalité. La majorité des patients n est pas éligible aux traitements curatifs chirurgicaux. Jusqu à récemment, aucun traitement systémique n a fait preuve d efficacité. Un effet modéré mais significatif en terme de survie a été obtenu en 2008 avec le sorafenib, un inhibiteur multicible. Cependant, peu de patients répondent au sorafenib et, lorsqu ils répondent, l émergence de résistance est rapidement objectivée. Les mécanismes de résistance au sorafenib sont encore mal connus. Dans la première partie de notre travail, nous avons évalué le rôle de la voie EGFR qui est fréquemment dérégulée au cours du CHC dans la résistance innée et acquise au sorafenib. Nous montrons que le gefitinib, un inhibiteur de l activité tyrosine kinase de EGFR améliore l effet antitumoral du sorafenib in vitro et in vivo dans les lignées de CHC naïves. Le gefitinib prévient l activation paradoxale de EGFR et des kinases AKT et ERK par le sorafenib montrant le rôle de EGFR dans la résistance innée au médicament. L exposition chronique des cellules de CHC au sorafenib induit une résistance et s accompagne d une activation de boucles autocrines de ligands de EGFR (tels que amphiréguline), une hyperactivation de EGFR/HER3 et des voies de signalisation en aval. Les cellules résistantes au sorafenib sont plus sensibles au gefitinib que les cellules parentales. Enfin, nous avons observé une augmentation significative des taux sériques d amphiréguline chez 10 patients sur 14 traités par le sorafenib pour un CHC avancé par rapport aux taux sériques mesurés avant traitement. L obésité, le diabète de type 2 et le syndrome métabolique sont en constante augmentation et représentent des facteurs de risque émergents pour le CHC. Plusieurs arguments suggèrent que l hyperinsulinémie observée dans ces pathologies pourrait contribuer à la carcinogenèse hépatique. Deux isoformes du récepteur de l insuline (IR) ont été caractérisées, IR-A et IR-B, issues de l épissage alternatif de l ARNm. IR-B est majoritaire dans le foie adulte tandis que IR-A est spécifique du foie fœtal. IR-A est surexprimée dans les cancers du sein et du colon mais son statut dans le CHC ainsi que les mécanismes de sa surexpression sont inconnus. Dans la seconde partie de notre étude, nous montrons que l expression de IR-A ainsi que le ratio IR-A/IR-B sont augmentés dans les tumeurs de CHC (n=85) en comparaison avec le foie adjacent non tumoral et ceci quelque soit l étiologie. IR-A est également surexprimée dans les lignées en comparaison avec les hépatocytes humains normaux et le ratio IR-A/IR-B est corrélé à la réponse proliférative à l insuline et à l IGF-II. En utilisant des inhibiteurs pharmacologiques et des ARN interférents, nous montrons que l activation autocrine et paracrine de la voie EGFR/MEK augmente le ratio IR-A/IR-B dans les lignées de CHC via l induction d expression des facteurs d épissage CUGBP1, hnRNP (H et A2B1) et SF2/ASF. La surexpression de IR-A a été confirmée dans un modèle de CHC sur cirrhose chez le rat mais pas dans un modèle de régénération hépatique. En conclusion, nos travaux ont caractérisé deux nouvelles fonctions pour EGFR dans le CHC. Ainsi, l activation d EGFR est impliquée dans la résistance innée et acquise au sorafenib. La combinaison du sorafenib avec un anti-EGFR pourrait être efficace pour le traitement palliatif du CHC avancé. EGFR est également impliqué dans la promotion de l expression de IR-A. IR-A pourrait être un avantage moléculaire promouvant la croissance de CHC dans un contexte d hyperinsulinémieHepatocellular carcinoma (HCC) is a cancer with poor prognosis. It is the 6th most common cancer and the 3rd leading cause of cancer-related death worldwide. Most patients are not eligible for curative surgery. Until recently, no systemic treatment has been effective. A moderate but significant effect on survival was obtained in 2008 with sorafenib, a multi-target inhibitor. However, only few patients respond to sorafenib, and when they respond, the emergence of resistance occurs rapidly. Mechanisms of resistance to sorafenib are still poorly understood. In the first part of our work, we evaluated the role of the EGFR pathway, frequently deregulated in HCC in innate and acquired resistance to sorafenib. We show that gefitinib, a tyrosine kinase inhibitor of EGFR enhances the antitumor effect of sorafenib in vitro and in vivo in naive HCC cell lines. Gefitinib prevents paradoxical activation of EGFR and ERK and AKT kinases induced by sorafenib suggesting the role of EGFR in the innate resistance to the drug. Chronic exposure of HCC cells to sorafenib induced resistance and is accompanied by activation of autocrine loops of EGFR ligands (such as amphiregulin), hyperactivation of EGFR/HER3 and downstream signaling pathways. Sorafenib-resistant cells are more sensitive to gefitinib than the parental cells. Finally, we observed a significant increase of serum amphiregulin in 10 of 14 patients treated with sorafenib for advanced HCC compared to serum levels measured before treatment. Obesity, type 2 diabetes and metabolic syndrome are steadily increasing pathologies and represent emerging risk factors for HCC. Many arguments suggest that hyperinsulinemia observed in these pathologies may contribute to liver carcinogenesis. Two isoforms of the insulin receptor (IR) have been characterized, IR-A and IR-B, resulting from the alternative splicing of IR mRNA. IR-B is the main isoform expressed in the adult liver while IR-A is essentially expressed during liver development. IR-A is overexpressed in breast and colon cancers, but its status in HCC and its overexpression mechanisms are unknown. In the second part of our study, we show that the expression of IR-A and the ratio IR-A/IR-B are increased in HCC tumors (n = 85) compared with the adjacent non-tumor liver regardless of the etiology. IR-A is also overexpressed in HCC cell lines compared with normal human hepatocytes and the ratio IR-A/IR-B is correlated to the proliferative response to insulin and IGF-II. Using pharmacological inhibitors and RNA interference, we show that autocrine and paracrine activation of the EGFR/MEK pathway increases the ratio IR-A/IR-B in HCC cell lines through the overexpression of the splicing factors CUGBP1, hnRNP (H and A2B1) and SF2/ASF. Overexpression of IR-A was confirmed in a rat model of HCC on cirrhosis but not in a model of liver regeneration. In conclusion, we have characterized two new functions for EGFR in HCC. Thus, activation of EGFR is involved in the innate and acquired resistance to sorafenib. The combination of sorafenib with an anti-EGFR may be effective for the palliative treatment of advanced HCC. EGFR is also involved in promoting the expression of IR-A. IR-A could be a molecular advantage promoting HCC growth in a context of hyperinsulinemiaPARIS-BIUSJ-Biologie recherche (751052107) / SudocSudocFranceF