Rôle de la protéine spermatique Izumo1 dans l'interaction gamétique chez le murin

Les étapes d adhésion et de fusion entre l ovocyte et le spermatozoïde sont des étapes cruciales dans le processus de fécondation. Cependant, de nombreuses questions sont posées aujourd hui à propos des processus moléculaires qui sous-tendent la réussite de ces étapes. Ces dernières années, un nombre important de molécules clés ont été identifiées comme ayant un rôle majeur dans l interaction gamétique. A ce jour, la seule protéine membranaire connue dont l absence cause un échec total de la fécondation est la protéine spermatique Izumo1. Izumo1 est une protéine transmembranaire, membre de la famille des protéines Izumo et de la superfamille des Immunoglobulines. Malgré son rôle clé dans l interaction gamétique, ses propriétés fonctionnelles en tant que protéine d adhésion, de fusion ou ayant la capacité d organiser des réseaux comprenant des protéines de fusion n est pas encore élucidé. Dans cette étude nous nous sommes intéressés au rôle d Izumo1 dans l interaction gamétique. Pour cela, nous avons généré deux variantes exogènes de la protéine Izumo1 et les avons surexprimées à la membrane de plusieurs lignées cellulaires. L interaction entre ces cellules exprimant la protéine et l ovocyte a été analysée au moyen d une technique de micromanipulation de cellules couplée à l imagerie confocale. Nous avons ainsi mis en évidence une forte adhésion entre les cellules exprimant Izumo1 et les ovocytes et nous avons quantifié sa cinétique. Nous avons également généré le domaine extracellulaire recombinant afin de déterminer si Izumo1 seule était capable de se lier directement à l ovocyte et comment. Nous avons sondé au moyen d une technique fine de mesure de forces, le biomembrane force probe, l interaction entre un Izumo1 unique et l ovocyte. Ces expériences permettent de confirmer que c est bien Izumo1 et non un partenaire qui est responsable de la forte adhésion entre cellules et ovocytes. Par observation en microscopie confocale d un ovocyte interagissant avec des cellules surexprimant Izumo1-GFP, nous avons observé l accumulation d Izumo1-GFP dans la zone d adhésion. Le fait que ce processus se reproduise lorsque plusieurs cellules adhèrent à l ovocyte suggère qu Izumo1 possède une molécule partenaire largement exprimée à la membrane de l ovocyte avec laquelle il interagit pour créer de l adhésion.Adhesion and fusion between oocyte and sperm are crucial in the process of fertilization. Many questions about the molecular mechanisms that underlie these processes are still open today. During the last two decades, several proteins have been identified as playing an active role in mediating gametic interaction. However, the only transmembrane protein whose absence is known to cause a total defect of fertilization is the sperm protein Izumo1. Izumo1 belongs to the Izumo protein family, in turn belonging to the Immunoglobulin superfamily. Despite its essential role in mediating gametic fusion, it has not yet been determined whether the protein acts as an adhesion or fusion molecule, or as an organizer of proteins required for fusion or adhesion. This study has focused on the determination of the role of Izumo1 in the gamete interaction process. We have generated a transgenic construct, allowing the overexpression of Izumo1 on three different cell lines. We have then analyzed the interaction of Izumo1-expressing cells and oocytes with micromanipulation force measurement assays coupled to confocal imaging. We observed a strong adhesion of cells expressing Izumo1 with membrane oocytes and quantified the interaction kinetics. In addition, we generated a recombinant Izumo1 extracellular domain, to investigate whether Izumo1 alone is sufficient to bind to the oocyte. We have probed the interaction of Izumo1 and the oocyte at the single molecule level using the biomembrane force probe technique. These experiments confirmed that Izumo1, and not one of its partners, is responsible for the strong adhesion between Izumo1-expressing cells and oocytes. Finally, we observed that oocyte can interact with multiple Izumo1-GFP-expressing cells at the same time and that Izumo1-GFP accumulated in the contact area. Both observations suggest that the molecular partner of Izumo1 is widely expressed on the oocyte membrane.PARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF