Caractérisation des déterminants moléculaires de virulence de souches européennes ou méditerranéennes du virus West Nile

West Nile virus (WNV) is a neurotropic arbovirus transmitted by mosquito bites that can infect a wide variety of animal species. The natural reservoir of the WNV is composed by the wild bird fauna.The aim of my work was to characterize the molecular determinants of virulence of European or Mediterranean strains of the West Nile virus. To achieve this objective, I relied on the laboratory's previous work, namely the production of an infectious clone of the strain IS-98-ST1. We also used the strain Italy 2008 (It08) (strain 229892, GENBANK: FJ483549) which is considered to be pathogenic.I constructed chimeric viruses (by exchange of genomic fragments between the WNV Is98 and It08 strains) or mutants (integration of the NS3-P249T mutation) from the infectious clone Is98 and ensured their amplification on Vero cells. I have characterized their biological properties in in vitro cell lines and in vivo models (mouse, mammalian model for West Nile virus virulence, and birds: 1-day chick in partnership with CERVA CODA, Belgium).In vitro I observed that the viruses Is98, It08 and Chimera 3 behave differently from those of chimera 4 and the mutant Thr (small lysis areas). Kinetics of infections in VERO cells suggest that chimera 4 and mutant NS3 P249T do not exhibit a replication defect in this cell model.For the NS3 mutant, our in vivo results suggest that virulence of WNV is strongly impacted in the murine or avian host by the presence of the Proline residue at position 249 on the NS3 reading frame in a more global Is98 genomic context .For chimeric viruses, the survival curves in the murine model are comparable for the different viruses tested (Is98, It08, Chimera 3 and 4), while the RT-qPCR analyzes of the different samples show lower viral loads after infection with The chimera 4. Differences in the behavior of chimera 4 suggest that it induces a viremia shifted in time compared to other viruses (a priori later). Infections in the avian model demonstrated statistically significant differences in viral loads measured in different peripheral compartments and in oral swabs after infection with different viruses. Comparable survival curves and viral loads were observed after infection of SPF chicks of 1J respectively between the virus It08 and the chimera 3 (viral loads in the different samples taken, low mortality) and between the virus Is98 and the chimera 4 (oral excretion and high peripheral viral loads, higher mortality).The set of results I obtained allowed me to objectify the role of three different determinants for WNV virulence, NS3 zone 249, NS4A / B and NS5. However, it seems that their impacts are different depending on the target host and that in order to have a real idea of ​​the virulence of a WNV strain, the part of the mutated genome and the target host species must be taken into account.These determinants appear to be "major" determinants of the replicative capacity or "fitness" of WNV to its host. That is, they play a preponderant role in the intrinsic ability of the virus to replicate and escape the host-specific immune system.We can think for the future that the discovery of the virulence factors of this virus will allow us to determine the virulence factors of other types of flaviviruses. This will probably enable us to rapidly characterize the epizootic or epidemic potential of a given strain and to consider ways of fighting these arboviruses more effectively (vaccines, antivirals, etc.)Le virus West Nile (VWN) est un arbovirus neurotrope transmis par piqûre de moustique et pouvant infecter une grande variété d’espèces animales. Le réservoir naturel du VWN est composé par la faune aviaire sauvage. L’objectif de mon travail était de caractériser les déterminants moléculaires de virulence de souches européennes ou méditerranéennes du virus West Nile. Pour atteindre cet objectif, je me suis appuyé sur le travail antérieur du laboratoire, à savoir la production d’un clone infectieux de la souche IS-98-ST1. Nous avons aussi utilisé la souche Italie 2008 (It08) (souche 229892, GENBANK : FJ483549) qui est réputée peu pathogène. J’ai réalisé la construction de virus chimères (par échange de fragments génomiques entre les souches de VWN Is98 et It08) ou mutants (intégration de la mutation NS3-P249T) à partir du clone infectieux Is98 et assuré leur amplification sur cellules Vero. J’ai caractérisé leurs propriétés biologiques dans des lignées cellulaires in vitro et dans des modèles in vivo (souris, modèle mammifère permettant l’évaluation de la virulence du virus West Nile, et oiseaux : poussin de 1 jour en partenariat avec le CERVA CODA, Belgique).In vitro j’ai observé que les virus Is98, It08 et Chimère 3 ont un comportement différent de ceux de la chimère 4 et du mutant Thr (plages de lyse de petite taille). Des cinétiques d’infections en cellules VERO semblent indiquer que la chimère 4 et le mutant NS3 P249T ne présentent pas de défaut de réplication dans ce modèle cellulaire.Pour le mutant NS3, nos résultats in vivo tendent à suggérer que la virulence de VWN est fortement impactée chez l’hôte murin ou aviaire par la présence du résidu Proline en position 249 sur le cadre de lecture de NS3 dans un contexte génomique Is98 plus global. Pour les virus chimères, les courbes de survie en modèle murin sont comparables pour les différents virus testés (Is98, It08, Chimères 3 et 4), alors que les analyses par RT-qPCR des différents prélèvements démontrent des charges virales plus faibles après infection par la chimère 4. Les différences de comportement de la chimère 4 amènent à penser que celle-ci provoque une virémie décalée dans le temps par rapport aux autres virus (a priori plus tardive). Les infections en modèle aviaire ont permis de démontrer des différences statistiquement significatives dans les charges virales mesurées dans différents compartiments périphériques et dans les écouvillons oraux après infection par les différents virus. Des courbes de survie et des charges virales comparables ont été observées après infection des poussins SPF de 1J respectivement entre le virus It08 et la chimère 3 (charges virales dans les différents prélèvements effectués faibles, mortalités plus faibles) et entre le virus Is98 et la chimère 4 (excrétion orale et charges virales périphériques élevées, mortalités plus élevées). L’ensemble des résultats que j’ai obtenu m’a permis objectiver le rôle de trois déterminants différents pour la virulence du VWN, la zone NS3 249, NS4A/B et NS5. Mais il semble que leurs impacts soient différents selon l’hôte ciblé et que pour avoir une idée réelle de la virulence d’une souche de VWN, il faille tenir compte de la partie du génome muté et de l’espèce hôte ciblée.Ces déterminants semblent être des déterminants « majeurs » de la capacité réplicative ou du « fitness » du VWN vis-à-vis de son hôte. C’est-à-dire qu’ils jouent un rôle prépondérant dans la capacité intrinsèque du virus de se répliquer et d’échapper au système immunitaire spécifique de son hôte.On peut penser pour le futur que la découverte des facteurs de virulence de ce virus nous permettra de déterminer les facteurs de virulences d’autres types de flavivirus. Ceci pourra sans doute nous permettre de caractériser rapidement le potentiel épizootique ou épidémique d’une souche donnée et d’envisager des moyens de lutter plus efficacement contre ces arbovirus (vaccins, antiviraux etc…