Identification et caractérisation des facteurs cellulaires requis pour l’infection du virus Zika et du virus de la Dengue

Les virus de la Dengue (DENV) et Zika (ZIKV) sont deux virus émergents transmis par des moustiques et sont responsables de pathologies sévères chez l’homme. Il n’y a actuellement aucun vaccin efficace, ni traitements antiviraux disponibles contre ces arbovirus. DENV et ZIKV sont des parasites intracellulaires obligatoires qui dépendent entièrement de leur cellule hôte pour se multiplier. Cette dépendance constitue un potentiel talon d’Achille qui pourrait être exploité dans le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif général de mon travail de thèse a été de comprendre a été de comprendre les mécanismes par lesquels DENV et ZIKV exploitent les fonctions cellulaires à leur avantage, et d’identifier des facteurs de l’hôte requis à l’initiation de leur cycle infectieux.ZIKV a un tropisme cellulaire pour le cerveau et est responsable de troubles neurologiques sévères tels que les microcéphalies congénitales chez le fœtus. La première partie de mon travail a été de caractériser le rôle du récepteur Axl dans le neurotropisme de ZIKV. Axl est un récepteur à la phosphatidylsérine appartenant à la famille des récepteurs TAM, qui est impliqué dans la reconnaissance et l’élimination des cellules apoptotiques par phagocytose. Ce travail de thèse a montré qu’Axl est abondamment exprimé par les cellules microgliales, les cellules gliales radiales et les astrocytes dans le cerveau en développement de fœtus et est important pour l’infection de ces cellules par ZIKV. Nous décrivons deux rôles distincts joués par Axl durant l’infection par ZIKV. Tout d’abord, Axl, par l’intermédiaire de son ligand Gas6, permet l’attachement et l’endocytose des particules virales dans les cellules gliales. Dans un deuxième temps et simultanément à l’entrée virale, les complexes Gas6-ZIKV agissent comme des « super » agonistes et phosphorylent le domaine intracellulaire à tyrosine kinase d’Axl, ce qui déclenche des cascades de transduction du signal aboutissant à l’inhibition de la réponse immunitaire innée et à une réplication virale optimale. En outre, nous avons identifié deux antagonistes d’Axl, le MYD1 et le R428, et avons montré leurs prometteuses propriétés antivirales en in vitro.La deuxième partie de mon travail a consisté à identifier de façon systématique les gènes de la cellule hôte qui sont importants pour le cycle infectieux de DENV. A l’aide d’un crible CRISPR-Cas9 à l’échelle du génome, nous avons identifié les protéines DPM1 et DPM3 comme de nouveaux facteurs de dépendance de DENV. DPM1 et DPM3 sont deux sous-unités du complexe dolichol-phosphate-mannose synthase (DPMS), localisé à la membrane du réticulum endoplasmique. Ce complexe catalyse la synthèse du dolichol-phosphate-mannose, qui fournit le mannose requis pour les différentes voies de glycosylation des protéines. A l’aide de cellules DPM knockout, nous avons montré que le complexe DPMS facilite l’infection des quatre sérotypes de DENV mais aussi de ZIKV ainsi que d’autres flavivirus apparentés tel que le virus de la fièvre jaune. A l’aide de mutants catalytiques de DPM1, nous avons pu décrire que l’activité catalytique de DPMS est cruciale pour l’infection par DENV. Nous avons montré que le complexe DPMS accomplissait différentes fonctions au cours du cycle infectieux de DENV. Ce complexe est nécessaire au mécanisme d’amplification du génome viral et, est également requis pour la N-glycosylation des protéines virales structurales, qui permet ainsi leur repliement correct.En conclusion, ces travaux ont contribué à améliorer notre compréhension des mécanismes d’entrée et de réplication de deux arbovirus majeurs, que sont ZIKV et DENV. Nos études ont identifié Axl et le complexe DPMS comme des facteurs cellulaires importants pour le cycle infectieux de ZIKV et DENV et suggèrent que ces molécules pourraient constituer de nouvelles cibles pour une intervention antivirales.Dengue virus (DENV) and Zika virus (ZIKV) are two emerging viruses transmitted to humans by mosquitoes and are responsible for severe pathologies. There is currently no efficient vaccine neither antiviral treatment available against these arboviruses. DENV and ZIKV are fully dependent on the host cell for their multiplication. This dependence creates a “Achille’s heel” that may be exploited to develop new approaches to treat these viral infections. The general objective of my PhD is to understand the mechanisms by which DENV and ZIKV exploit the cellular functions for their advantage and to identify the host factors required for the initiation of their viral life cycle.ZIKV displays a cellular tropism for the brain and is responsible for severe neurological disorders such as congenital microcephaly in the fetus. The first part of my work was to characterize the role of the Axl receptor in the ZIKV neurotropism. Axl is a phosphatidylserine receptor belonging to the TAM receptor family, which is involved in the recognition and the removal of the apoptotic cells by phagocytosis. This work showed that Axl is highly expressed by microglial cells, radial cells and astrocytes in developing brain of fetuses and is important for ZIKV infection of these cells. We described two distinct roles played by Axl during ZIKV infection. First Axl, through its ligand Gas6, promotes the adsorption and the endocytosis of viral particles into glial cells. Second and simultaneously to the viral entry, the Gas6-ZIKV complexes act a ‘super agonist” that phosphorylate Axl tyrosine kinase domain to trigger signaling cascades that lead to the inhibition of the innate immune response and optimal viral replication. Furthermore, we identified two antagonists of Axl, the MYD1 and the R428, and showed their promising antiviral properties in vitro.The second part of my work aims to identify the cellular genes required for DENV infection. Using a genome-wide CRISPR-Cas9 screen, we identified the DPM1 and DPM3 proteins as new DENV host dependency factors. DPM1 and DPM3 are two subunits of the dolichol-phosphate-mannose synthase (DPMS) complex. This latter catalyzes the dolichol-phosphate-mannose synthesis, which provides the mannose required for the different glycosylation pathways in the ER lumen. Using DPM knockout cells, we showed that the DPMS complex facilitates the infection of the four DENV serotypes as well as other flaviviruses such as ZIKV and yellow fever virus (YFV). Using DPM1 mutants, we found that the catalytic activity of DPMS is crucial for DENV infection. We showed that DPMS complex plays several functions during the DENV life cycle. This complex is necessary for the replication of the viral genome, and is also required for the N-glycosylation of structural viral proteins, which allows their correct folding.In conclusion, this PhD work provides new insights for our understanding of the entry and replication mechanisms of two major arboviruses. These studies identified Axl and the DPMS complex as important cellular factors required for ZIKV and DENV life cycle and suggest that targeting these molecules may represent new strategies to combat DENV and ZIKV infection