Pathophysiology of genetic defects in pediatric Systemic Lupus Erythematosus

Notre laboratoire a découvert chez une famille de patients atteints de Lupus une mutation hétérozygote du gène ERN1 codant pour la protéine IRE1a : le principal inducteur de la réponse aux protéines mal conformées (UPR). L'UPR est un programme transcriptionnel ayant pour but de restaurer la fonction du réticulum endoplasmique (RE) lorsque celui-ci est surchargé de protéines mal conformées, un phénomène également appelé stress du RE. Le stress du RE va induire l'UPR par l'activation d'IRE1a, provoquant une réponse pro-survie dédiée au retour à l'homéostasie du RE dans le cas d'un stress aigu ou pro-apoptotique dans le cas d'un stress chronique. Par expression de la version humaine sauvage et mutée de la protéine dans la levure à l'état homozygote nous avons montrés que la mutation entraine une perte de fonction totale de son activité RNAse et partielle de son activité kinase. Avec un système de surexpression de IRE1a dans une lignée HEK293, nous avons confirmé que la protéine mutée était bien exprimée par des cellules humaines et cela malgré un fort impact de la mutation sur la protéine révélée par nos analyses in silico. Ces résultats nous ont orienté vers un modèle de mutation dominante négative, IRE1a fonctionnant sous la forme de dimères ou d'oligomères. Les analyses moléculaires de l'UPR réalisées sur des lymphocytes B immortalisés par le virus Epstein-Barr (B-EBV) issues du patient index montrent un épissage retardé d'XBP1, la cible principale de l'activité RNAse d'IRE1a, observable par l'expression diminuée de sa forme épissée (XBP1s) et augmentée de sa forme totale (XBP1u). Le ratio XBP1s/XBP1u confirme ce changement dans la régulation temporelle de la voie IRE1a-XBP1 qui montre des signes croissants d'activité jusqu'à 48h alors que la voie retourne à l'homéostasie chez les contrôles. Cette dérégulation ne semble pas modifier l'expression des cibles observées de ce facteur transcriptionnel : EDEM1, DNAJB9 et DNAJC3. En revanche, l'expression d'IL6 est fortement augmentée à l'état basal ainsi qu'après stimulation à la tunicamycine. Les analyses fonctionnelles ont montré une résistance à l'apoptose extrinsèque des B-EBV du patient index et cela sans diminution de l'expression des récepteurs FAS et TRAIL à la membrane. Cette résistance pourrait être à l'origine du phénotype d'auto-immunité présenté par les divers membres de la famille porteurs de la mutation. Une analyse par Western Blot a montré une expression diminuée de Caspase-3 comparée à un contrôle. Caspase-3 étant une cible du RIDD (Regulated IRE1a-dependent decay of mRNA), une activité de dégradation des ARNm issue de l'activité RNAse d'IRE1a, notre hypothèse est que l'activation augmentée dans le temps d'IRE1a va provoquer une perturbation dans l'induction de l'apoptose par l'UPR, la voie IRE1a devant être désactivée pour induire la mort cellulaire. La voie IRE1a-XBP1 possède des liens directs avec la voie PI3K : via l'association entre XBP1 et p85a/b pour augmenter sa translocation nucléaire d'une part et via l'inhibition induite d'IRE1a par la réactivation de la voie PI3K après induction d'un stress du RE d'autre part. Or, deux familles présentant un lupus ou un tableau clinique proche de nos patients ERN1, sont également porteurs de mutation dans PIK3R1 et PIK3R2 codant pour p85a/b, deux protéines essentielles à la signalisation de la voie PI3K/AKT. La voie PI3K/AKT étant importante pour la prolifération et la survie cellulaire et la phosphorylation d'AKT étant fortement diminuée dans notre modèle B-EBV ERN1 KO, nous supposons que des défauts de cette voie peuvent également converger vers la voie IRE1a-XBP1 et induire une auto-immunité par résistance à l'apoptose extrinsèque. Ces travaux renforcent la notion d'un lien entre le stress du RE et l'auto-immunité, apportant un premier élément de réponse par la description de ces cas de lupus monogénique.Our laboratory discovered in a familial case of lupus an heterozygous mutation or the ERN1 gene coding for the IRE1a protein : the major inducer of the Unfolded Protein Response (UPR). The UPR is a transcriptional program which can restore the function of the endoplasmic reticulum (ER) when it is overloaded with unfolded proteins, a process also called ER stress. The ER stress will induce the UPR by the activation of IRE1a, activating a pro-survival response to return to homeostasis in case of a acute stress or a pro-apoptotic response in case of a chronic stress. By expression the wild type and mutated human version of the protein in the yeast at the homozygous state, we showed that the mutation induces a complete RNAse and a partial kinase loss of function. With a cellular system overexpressiong IRE1a in a HEK293 cell line, we confirmed that the mutated protein can be expressed in human cells despite a strong impact of the mutation on the protein, as showed by our in silico analysis. These results have oriented us towards a dominant negative mutation model as IRE1a works as a dimere or an oligomere. Molecular analysis of the UPR on B lymphocytes immortalized by the Epstein-Barr virus (B-EBV) coming from our patient of interest showed a splicing delay in XBP1, the main target of IRE1a RNAse activity, as we could see it with a diminished XBP1 splice form expression (XBP1s) and an increased unspliced form expression (XBP1u). The XBP1s/XBP1u ratio confirms this temporal dysregulation of the IRE1a-XBP1 pathway which shows increasing activity until 48h in the patient, while the controls already returned to homeostasis. This dysregulation didn't modify the expression of XBP1 transcriptional targets : EDEM1, DNAJB9, DNAJC3. However, the expression of IL6 was greatly increase both at basal state and after tunicamycin treatment. The functional analysis demonstrated a resistance of B-EBV to extrinsic apoptosis in the patient of interest, without any diminution of FAS and TRAIL receptors at the membrane. This resistance could be at the origin of the autoimmune phenotype observable on the family members carrying the mutation. A Western Blot analysis showed a diminished expression of Caspase-3 compared to a control. As Caspase-3 is a target of the RIDD (Regulated IRE1a-dependant decay of mRNA), a mRNA degradation activity linked to the RNAse activity of IRE1a, our hypothesis is that the longer activation of IRE1a will induce a dysregulation of apoptosis induction in the UPR, as IRE1a needs to be desactivated to induce cell death. The IRE1a-XBP1 pathway also presents direct links with the PI3K/Akt pathway : first through the association of XBP1 and p85a/b to increase XBP1 nuclear translocation, second through the inhibition of IRE1a induced by the reactivation of the PI3K/Akt pathway after induction of ER stress. Moreover, two families presenting lupus cases or a clinical table close to our ERN1 patients are also carriers of PIK3R1 and PIK3R2 mutations, coding for p85a and p85b, two proteins essential for the signalisation of the PI3K/Akt pathway. Since this pathway is important for proliferation and cell survival and the fact that our B-EBV ERN1 KO cell line shows a strongly decreased phosphorylation of AKT, we suspect that defects of this pathway could converge to the IRE1a-XBP1 pathway and induce an autoimmunity with a resistance to extrinsic apoptosis. These data underlined the notion of a link between ER stress and autoimmunity, providing a first insight to this field by the description of these monogenic cases of lupus