РОЗРОБКА РЕКОМБIНАНТНОГО ПОЗИТИВНОГО КОНТРОЛЮ ВIРУСУ ДIАРЕЇ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ I ТА II ТИПУ ДЛЯ ВИКОРИСТАННЯ В ПЛР

Aim. The method of amplifying and cloning the Erns gene of Bovine Viral Diarrhea Virus was developed to obtain the positive controls for polymerase chain reaction. Methods. The strains used in this study were BVDV-1b (Ossloss) and BVDV-2 (Kosice). Viral RNA was extracted by the silica-based extraction method. Using the specific primers, a part of Erns gene was amplificated. The PCR product was inserted into the cloning vector pTZ57R/T. Furthermore, E. coli DH10B bacteria were transformed to amplify the recombinant plasmid. Recombinant clones were identified by antibiotic selection on agar plate and confirmed by PCR. Moreover, insert of Erns gene was verified by restriction enzyme digestion assay using EcoRI and HindIII. Results. It was shown that we had constructed the recombinant plasmids with insertion Erns gene fragment (826 base pair) of BVDV-1 and BVDV-2. Conclusion. The obtaibed recombinant plasmids can be used as a positive control for PCR.Цель. Разработка метода амплификации и клонирования гена Erns вируса диареи крупного рогатого скота с целью получения положительного контроля для полимеразной цепной реакции. Методы. В работе использованы вирусы диареи (ВД) КРС I типа штамм Ossloss и II типа штамм Kosice. Вирусную РНК экстрагировали с помощью метода аффинной сорбции. Ам плификацию участка гена Erns осуществляли с использованием специфических праймеров. ПЦР -продукт был интегрирован в вектор для клонирования pTZ57R/T. Для накопления рекомбинантных плазмид проводили трансформацию клеток бактерии E. coli DH10B. Плазмидсодержащие клоны выявляли с помощью селективной питательной среды, наличие вставки – методом ПЦР . Присутствие вставки гена Erns подтверждали с использованием рестрикционного анализа с помощью рестриктаз EcoRI и HindIII. Результаты. В ходе проведенных исследований сконструированы рекомбинантные плазмиды, содержащие вставки фрагмента гена Erns (826 пар нуклеотидов) возбудителей ВД КРС I и II типов. Выводы. Полученные рекомбинантные плазмиды могут быть использованы в качестве положительного контроля для ПЦР.Мета. Розробка методу ампліфікації та клонування гену Erns вірусу діареї великої рогатої худоби з метою отримання позитивного контролю для полімеразної ланцюгової реакції. Методи. У роботі були використані віруси діареї (ВД) ВРХ I типу штам Ossloss та II типу штам Kosice. Вірусну РНК екстрагували за допомогою методу афінної сорбції. Ам пліфікацію ділянки гену Erns здійснювали з використанням специфічних праймерів. ПЛР -продукт був інтегрований до вектору для клонування pTZ57R/T. Для напрацювання рекомбінантних плазмід проводили трансформацію клітин бактерії E. coli DH10B. Плазмідвмісні клони виявляли за допомогою селективного поживного середовища, вставку – методом ПЛР . Наявність вставки гена Erns підтверджували за допомогою рестрикційного аналізу з використанням рестриктаз EcoRI та HindIII. Результати. В ході проведених досліджень були сконструйовані рекомбінантні плазміди, які несуть вставку фрагменту гену Erns (826 пар нуклеотидів) збудників ВД ВРХ I та II типів. Висновки. Отримані рекомбінантні плазміди можуть використані як позитивний контроль для ПЛР