Développement de nouvelles méthodes de microscopie et d’électrochimie pour des analyses multi-paramétriques de mitochondries individuelles cardiaques

The importance of mitochondria in the regulation of cellular metabolism, from physiological (cardiac contraction, etc.) or pathological (cancer, Alzheimer's, etc.) processus are well established. In the context of heart contraction, which is a highly ATP-dependent process, the exact intervention of the mitochondrion remains a subject of debate today. One hypothesis suggests that the mitochondria see only a small percentage (1%) of the calcium flow necessary for contraction, while another hypothesis suggests that the mitochondria, which produce 90% of cellular ATP, are activated by this calcium flow at each contraction to supply energy demand. Part of the answer may be in the opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), which is mainly activated by calcium. If this non-specific pore is well described for its pathological opening, notably in ischemia-reperfusion by triggering apoptosis, this is its physiological opening mode which would be important in the cardiac context by playing a crucial role in the control of mitochondrial calcium flows. However, this mode of opening is still weakly characterized, in particular because the techniques used are often based on the average monitoring of large mitochondrial populations. However, more and more studies show the existence of mitochondrial subpopulations within a cell, with differences in activities between them. The objective of this study was to develop new methods of analysis, in order to be able to follow the variations of activities of the populations but especially, to be able to analyze individual mitochondria. By Based on these methods, we could study the patho-physiological openings of mPTP in the context of heart contraction was conducted.The first approach that I developed is based on optical microscopy, it consists of three main steps: 1) processing of microscopy images, 2) identification of mitochondria and their monitoring them over time, 3) data analyses. The second approach was based on electrochemistry, we performed a simultaneous detection of mitochondrial oxygen consumption and the reduction rate of quinones of the respiratory chain. To characterize these methods, we first followed the classical mitochondrial bioenergetic states. We have thus shown a wide variety of responses with the observation of two mitochondrial subpopulations of distinct sizes. Then, in a second step, we used fluorescence microscopy to follow, at the single mitochondrion level, transient variations in the membrane potential that we connect to the openings of the mPTP. We have thus confirmed that the activation of the pathological opening mode can be induced by a calcium concentration transient, and is inhibited by cyclosporin A (CsA). Strikingly, we observed transient openings of mPTP, activated also by calcium and by photo-illumination as well, however in our study this mode of opening is not inhibited by CsA which suggests a different mechanism.L’importance de la mitochondrie dans la gestion de l’énergie cellulaire, d’un point de vue physiologique (contraction cardiaque, etc) ou pathologique (cancer, Alzheimer, etc) n’est plus à démontrer. Dans le contexte de la contraction cardiaque, qui est un processus fortement ATP-dépendant, l’intervention exacte de la mitochondrie reste aujourd’hui sujet à débat. Une hypothèse avance que la mitochondrie ne voit qu’un faible pourcentage (1%) du flux calcique nécessaire à la contraction, une autre hypothèse propose que la mitochondrie, qui produit 90% de l’ATP cellulaire, est activée par ce flux calcique à chaque contraction pour répondre à la demande énergétique. Un élément de réponse pourrait être l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondrial (mPTP), qui est principalement activé par le calcium. Si ce pore non spécifique est principalement connu pour son ouverture pathologique, notamment dans l’ischémie-reperfusion en déclenchant l’apoptose, c’est son mode d’ouverture physiologique qui serait important dans ce contexte cardiaque en jouant un rôle crucial dans la gestion des flux calciques mitochondriaux. Cependant, ce mode d’ouverture est encore peu caractérisé, notamment car les techniques utilisées reposent bien souvent sur le suivi moyen de large population mitochondriales, or de plus en plus d’études montrent l’existence de sous populations mitochondriales au sein d’une même cellule, présentant des différences d’activités entre elles. L’objectif de cette étude était de développer des nouvelles méthodes d’analyse, afin de pouvoir suivre les variations d’activités des populations mais surtout, de pouvoir analyser les mitochondries individuellement. En utilisant ces méthodes, des études des ouvertures physio-pathologiques du mPTP dans le contexte de contraction cardiaque peuvent être menées.La première approche que j’ai développée est basée sur la microscopie optique, elle se compose de trois grandes étapes : 1) traitement des images de microscopie, 2) identification des mitochondries et leur suivi dans le temps, 3) analyses informatiques. La deuxième approche a été basée sur l’électrochimie, elle repose sur une détection simultanée de la consommation d’oxygène mitochondriale et du taux de réduction des quinones de la chaine respiratoire. Pour caractériser ces méthodes, nous avons dans un premier temps suivi les états bioénergétiques mitochondriaux classiques. Nous avons ainsi montré une grande variété de réponses avec l’observation de deux sous-populations mitochondriales de tailles distinctes. Puis, dans un deuxième temps nous avons utilisé la microscopie de fluorescence pour suivre sur mitochondrie unique, des variations transitoires du potentiel de membrane que l’on relie aux ouvertures du mPTP. Nous avons ainsi confirmé que l’activation du mode d’ouverture pathologique peut être induit par un front de concentration de calcium, et est inhibé par la cyclosporine A (CsA). Surtout, nous avons observé des ouvertures transitoires du mPTP, activé également par le calcium mais également par la photo-illumination, en revanche dans notre étude ce mode d’ouverture n’est pas inhibé par la CsA ce qui suggère d’un mécanisme différent