Estudio de los mecanismos implicados en la barrera de transmisión y en la patogenia de las enfermedades priónicas

Las enfermedades priónicas han sido descritas en numerosas especies de mamíferos, pudiendo tener un origen espontáneo, familiar o adquirido. Sin embargo, ciertas especies, entre ellas los miembros de la familia Canidae, han demostrado presentar una escasa susceptibilidad a estos procesos. Algunas variantes aminoacídicas de la PrPC son factores determinantes en la susceptibilidad a las enfermedades priónicas. Estudios anteriores utilizando modelos murinos transgénicos revelaron la importancia del cambio aminoacídico N>D, característico de los cánidos, en la resistencia a diversas cepas priónicas. El estudio número 1 se diseñó con el objetivo de comprobar si la PrP con esta sustitución (PrP N158D) puede actuar como una proteína dominante negativa y prevenir la formación de PrPSc cuando se coexpresa con la proteína murina de tipo salvaje o wild-type. Los ratones transgénicos que coexpresaban la PrP mutada mostraron un incremento significativo del periodo de supervivencia (entre un 45 y un 113% de retraso en la aparición de la enfermedad), con respecto a ratones control que expresaban un nivel similar de PrPC wild-type, tras la inoculación de distintas cepas priónicas murinas (22L, ME7, RML y 301C). Asimismo, los ratones que expresaban la PrP mutada no mostraron alteraciones en las características neuropatológicas y bioquímicas desarrolladas, indicando que la prolongación del periodo de supervivencia no se debió a cambios en las cepas inoculadas causadas por el cambio aminoacídico introducido. Estos resultados demuestran que esta sustitución específica de los cánidos proporciona a la PrP la capacidad de actuar como proteína dominante negativa, atenuando la conversión de la PrPC en la forma patógena y retrasando la aparición de la enfermedad tras la inoculación de cepas priónicas de distintas características. El estudio número 2 surge como una continuación del primero. En este estudio se analiza el efecto de esta misma sustitución cuando se introduce en la PrPC de una especie muy susceptible a numerosas enfermedades priónicas. Como modelos de alta susceptibilidad a las EET se seleccionaron ratones transgénicos que sobreexpresaban la PrPC I109 del bank vole, la cual es tan susceptible al malplegamiento que su sola sobreexpresión ocasiona que estos ratones desarrollen una EET de forma espontánea, Así pues, en el segundo estudio se inocularon ratones TgVole-N159D, que sobreexpresan la PrPC I109 del bank vole y son portadores de la sustitución aminoacídica de interés, con dos cepas priónicas distintas la CWD-vole y una cepa atípica de origen espontáneo. Como resultado de ello se observó que estos animales presentaron periodos de supervivencia de un 52 a un 108% más largos que los obtenidos en ratones TgVole sin la sustitución. Además, este residuo aminoacídico fue capaz de prolongar el periodo de supervivencia, no sólo en los ratones inoculados, sino en en los que habían desarrollado la EET espontánea. Al igual que se observó en el estudio 1, no se detectaron diferencias entre las características neuropatológicas desarrolladas por ambos modelos transgénicos. Estos resultados demuestran que el cambio aminoacídico N>D característico de los cánidos produce un efecto protector frente a la propagación de priones de muy distinto origen, incluso cuando se expresa en una PrPC muy susceptible al malplegamiento. Estos dos primeros estudios indican que la sustitución aminoacídica N>D, típica de especies poco susceptibles a las EET, podría ser una candidata interesante en el desarrollo de futuras terapias génicas frente a estas enfermedades. Tras la crisis de la EEB y la aparición de la vECJ en la especie humana, el conocimiento de los mecanismos relacionados con la transmisibilidad de las EET entre especies se convirtió en un motivo de preocupación pública. La implicación de la glicosilación de la PrPC en la conversión en forma patógena de la proteína y en la transmisión interespecie de los priones se ha estudiado ampliamente, si bien se han obtenido resultados controvertidos. En el estudio número 3 se evalúa el efecto de la glicosilación de la PrPC humana en la barrera de transmisión y en las propiedades de distintas cepas priónicas. Se utilizaron aislados de scrapie clásico, scrapie atípico, ECC, BSE-L y BSE-H (EEB atípicas), BSE-C (EEB clásica), EEB ovina, EEB porcina y vECJ en experimentos in vitro e in vivo con el fin de analizar la capacidad de propagación de estos aislados en un modelo que expresa una PrPC humana sin glicosilar (línea transgénica TgNN6h). Sólo las cepas relacionadas con la BSE (BSE-C, EEB ovina, EEB porcina y vECJ) se propagaron en el sustrato humano no glicosilado, lo cual sugiere que la barrera de transmisión humana para las EET se mantuvo. En el bioensayo, a excepción de la vECJ, la inoculación directa de estos mismos aislados no provocó enfermedad en los ratones TgNN6h en un primer pase. Sin embargo, tras la adaptación al sustrato TgNN6h de tres aislados de EEB (bovina, ovina y porcina) por PMCA y la inoculación de estos en ratones se consiguió una transmisión muy eficiente. Los animales TgNN6h inoculados con los inóculos adaptados por PMCA o el aislado directo de vECJ desarrollaron las características neuropatológicas y bioquímicas clásicas de la EEB, lo cual sugiere que la ausencia de glicanos en la PrPC humana no altera las características patobiológicas de la EEB. Los mecanismos reguladores de la patogenia de las EET, especialmente los de las formas esporádicas de estos procesos, siguen siendo en su mayor parte desconocidos. Existen numerosos estudios que indican que la acumulación de proteínas malplegadas, no sólo en las enfermedades priónicas, sino en otras enfermedades neurodegenerativas, podrían inducir estrés del retículo endoplásmico y/o un bloqueo de la degradación proteica por parte del sistema ubiquitino-proteasómico. Por ello, en el estudio número 4 analizamos por medio de técnicas inmunohistoquímicas dos marcadores relacionados con estos procesos, en muestras de encéfalo de modelos murinos de EET espontánea (TgVole). Asimismo, estos ratones expresaban el marcador UbG76V-GFP (línea TgU1), cuya acumulación indica una disfunción de la degradación proteasómica. Por tanto, la acumulación de UbG76V-GFP se seleccionó como marcador del bloqueo de la degradación del sistema ubiquitino-proteasómico y la proteína PDI como marcador de estrés del retículo endoplásmico. Se seleccionaron ratones TgU1+/TgVole+ de distintas edades para evaluar estos procesos en las fases preclínica y clínica de la enfermedad espontánea. Como controles se seleccionaron ratones TgU1+/TgVole- de similares edades. Los animales TgU1+/TgVole+ clínicos mostraron una acumulación de PDI y UbG76V-GFP significativamente mayor que los controles de la misma edad en determinadas áreas del encéfalo. Sin embargo, en los ratones preclínicos TgU1+/TgVole+ no se detectó incremento significativo del estrés del retículo endoplásmico ni pérdida significativa de la función del proteasoma en ninguna de las regiones del encéfalo analizadas. Por ello, ninguno de estos procesos parece ocurrir tempranamente en la patogenia de las formas espontáneas de las EET. Se observó, asimismo, que los ratones TgU1+/TgVole+, especialmente los clínicos, mostraron una intensa acumulación de UbG76V-GFP en astrocitos reactivos. Estos resultados preliminares parecen indicar que tanto el estrés del retículo endoplásmico como la disminución de la degradación proteica por parte del proteasoma son mecanismos secundarios que aparecen asociados con el desarrollo de los cambios neuropatológicos en el encéfalo en las EET espontáneas, en lugar de mecanismos clave en la patogenia de estas enfermedades. Finalmente, en el estudio número 5 analizamos el patrón de distribución inmunohistoquímico de la PrPCWD en el SNC y en un amplio rango de tejidos periféricos procedentes de diez ciervos de cola blanca (Odocoileus virginianus) de distinto genotipo para el gen PRNP: 5 animales Q95G96/Q95G96 (wt/wt), 3 animales S96/wt, 1 animal H95/wt y 1 animal H95/S96. Estos ciervos se encontraban en la fase terminal de la ECC tras la inoculación oral de la cepa Wisc-1. Todos los animales mostraron un patrón de depósito de PrPCWD similar en el SNC, aunque se observaron diferencias entre los distintos genotipos en el cerebelo, lo cual podría estar asociado a interacciones entre el agente infeccioso y factores propios del hospedador, entre otros su genotipo para el gen PRNP. Asimismo, el animal H95/S96 acumuló menores niveles de PrPCWD en comparación con el resto de los genotipos en áreas rostrales del encéfalo, lo cual puede ser explicado por la existencia de un fenómeno de barrera de transmisión intraespecie o por ciertas diferencias en las propiedades de los priones acumulados por este animal. No obstante, el hallazgo más significativo de este estudio es que se observó que los ciervos que expresaban el alelo de resistencia H95 (los animales de los genotipos H95/wt y H95/S96) acumularon una cantidad no detectable, o significativamente menor de PrPCWD , en varios tejidos periféricos, en comparación con los demás genotipos. Las mayores diferencias se observaron en páncreas, corazón, riñón e intestino. Además, se describe por primera vez el depósito de PrPCWD, detectado mediante técnicas convencionales, en las arterias renales de cérvidos infectados por ECC. Por último, ninguno de los animales mostró acumulación de PrPCWD en el músculo esquelético. Estos cinco estudios han cumplido los objetivos descritos al inicio de la tesis, y contribuyen a conocer mejor los mecanismos reguladores de la barrera de transmisión para las EET, así como ciertos aspectos relacionados con su patogenia