Carbamazepine and diclofenac : biodegradation, metabolic pathways and fate in aerobic granular sludge reactors

The widespread occurrence of various types of emerging contaminants (ECs) has become an issue of high concern. Among ECs, pharmaceuticals and its metabolites deserve particular attention as their presence, continuous release and persistence in water bodies pose serious health issues affecting the entire ecosystem. It is important to understand the biodegradation of such molecules to devise strategies to avoid dispersal of these ECs in the environment. The work described in this thesis aimed at investigating of the microbial degradation of two pharmaceutical compounds, carbamazepine (CBZ) and diclofenac (DCF). On a first approach, selective enrichments using activated sludge from a municipal wastewater treatment plant (WWTP) were established for each pharmaceutical. One strain able to degrade DCF (strain Brevibacterium sp. D4) and two strains able to degrade CBZ (strains Starkeya sp. C11 and Rhizobium sp. C12) were isolated and their ability to biodegrade the pharmaceutical compounds supplied as a sole carbon source and with periodic feedings with acetate was assessed in batch cultures. Strain Brevibacterium sp. D4 was able to biodegrade ca. 35% of 10 mg L-1 of DCF supplied as a sole carbon source in 30 days. Supplementation with acetate enhanced biodegradation to ca. 90%. Both strains were able to degrade ca. 30% of 10 mg L-1 CBZ in 30 days, with no improvement in the presence of a supplementary carbon source. On a second approach, the biodegradation of each pharmaceutical compound by the bacterial strain Labrys portucalensis F11 was investigated. This strain was selected due to its ability to biodegrade recalcitrant compounds, including pharmaceuticals. CBZ biodegradation by strain F11 was assessed with the pharmaceutical supplied as sole carbon source, with ca 95% biotransformation of 10 mg L-1 CBZ achieved in 30 days. The supplementation with acetate led to complete CBZ biotransformation at a faster rate. Biotransformation of CBZ by strain F11 resulted in of 14 intermediary metabolites detected and identified using Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-Of-Flight Mass Spectrometry (UPLC-QTOF/MS/MS), which enabled the proposition of a biotransformation pathway. The toxicity of untreated and treated CBZ solutions was investigated using Vibrio Fischeri and Lepidium sativum acute toxicity tests and Toxi-Chromo Test. At concentrations ranging from 0.5 to 10 mg L-1 only Vibrio Fischeri was moderately affected by the presence of CBZ and/or its degradations products. DCF was supplied to strain F11 cultures as a sole carbon source at concentrations ranging from 0.5 to 10.0 mg L-1 and a biotransformation extent of ca 70% of DCF was achieved in 30 days, for the highest concentration. Supplementation with acetate resulted in complete degradation of 0.5 mg L-1 of DCF in 6 days and 10.0 mg L-1 of DCF in 25 days. Stoichiometric liberation of chlorine was observed. The identification of biodegradation intermediates was performed. A possible degradation pathway was proposed based on the chemical structure of 12 metabolites identified by UPLC-QTOF/MS/MS. The stoichiometric liberation of chlorine and the lack of detection of metabolites at the end of the experiments indicated complete degradation of DCF by strain F11. An aerobic granular sludge sequencing batch reactor (AGS-SBR), established using activated sludge from a WWTP and bioaugmented with strain F11, was used for the treatment of an aqueous stream containing DCF. Overall, the bioreactor main biological processes, such as Chemical Oxygen Demand (COD), nitrogen and phosphorous removal were not affected by the addition of DCF in the feeding stream at 10.0 mg L-1. Even though the AGS-SBR was not able to remove DCF, it was robust to maintain its main biological functions throughout the 286 days at different operational conditions. Along bioreactor operation, microbial community dynamics was monitored. Eleven bacterial culturable isolates were retrieved and tested for DCF biodegradation; the highest degradation obtained was of ca. 34% of 10.0 mg L-1 DCF supplied as a sole carbon source. The AGS displayed a diverse bacterial community, with visible changes along operation. Strain F11 was present throughout the entire reactor operation, as demonstrated by sequencing of bands excised from Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of extracted DNA. DCF biodegradation capability of the AGS was tested in batch mode with periodic feedings with acetate, resulting in ca. 72% removal of 10.0 mg L-1 DCF removal. The higher degradation extent of AGS compared to the degradation obtained by the retrieved isolates suggested that strain F11 was contributing to the process.A ocorrência de vários tipos de contaminantes emergentes (CEs) tornou-se um assunto de grande preocupação. Entre os CEs, os fármacos e os seus metabolitos merecem particular atenção, dado que a sua presença, liberação contínua e persistência nos ambientes aquáticos apresenta sérios problemas de saúde afetando todo o ecossistema. É crucial entender a biodegradação deste tipo de moléculas para planear estratégias para evitar a a sua dispersão no ambiente. O trabalho descrito nesta tese teve como objetivo a investigação da degradação microbiana de dois fármacos, carbamazepina (CBZ) e diclofenac (DCF). Numa primeira abordagem, foram estabelecidos enriquecimentos seletivos para cada fármaco usando lamas ativadas de uma estação de tratamento de águas residuais (ETAR). Uma estirpe capaz de degradar DCF (Brevibacterium sp. D4) e duas estirpes capazes de degradar CBZ (Starkeya sp. C11 e Rhizobium sp. C12) foram isoladas e a sua capacidade de biodegradar os compostos farmacêuticos suplementados como única fonte de carbono e com alimentação periódica com acetato foi avaliada em culturas líquidas. A estirpe Brevibacterium sp. D4 foi capaz de biodegradar ca. 35% de 10 mg L-1 of DCF, alimentada como fonte única de carbono em 30 dias. A suplementação com acetato aumentou a biodegradação ca. 90%. Ambas as estirpes foram capazes de degradar 30% de 10% L-1 de CBZ em 30 dias, sem melhoria na biodegradação com uma fonte suplementar de carbono. Numa segunda abordagem, a biodegradação de cada composto farmacêutico pela estirpe bacteriana Labrys portucalensis F11 foi investigada. Esta estirpe foi selecionada devido à sua capacidade de biodegradar compostos recalcitrantes, incluindo fármacos. A biodegradação da CBZ 10 mg L-1 de CBZ pela estirpe F11 foi de ca 95% em 30 dias. A suplementação com acetato resultou na completa biotransformação com uma taxa mais rápida. A biodegradação da CBZ pela estirpe F11 leva à produção de intermediários, tendo sido detetados e identificados 14 metabolitos intermediários usando Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-Of-Flight Mass Spectrometry (UPLC-QTOF/MS/MS), permitindo propor uma via de biotransformação. A toxicidade de soluções de CBZ não tratadas e tratadas foi investigada usando testes de toxicidade aguda Vibrio Fischeri e Lepidium sativum e o Toxi-Chromo Test. A concentrações entre 0.5 e 10 mg L-1 apenas Vibrio Fischeri foi moderadamente afetado pela presença de CBZ e/ou seus produtos de degradação. O DCF foi alimentado às culturas de F11 como uma única fonte de carbono a concentrações entre 0.5 to 10.0 mg L-1 e a biotransformação de ca 70% de DCF foi alcançada em 30 dias, para a concentração mais elevada. A suplementação com acetato resultou na completa degradação de 0.5 mg L-1 de DCF em 6 dias e de 10.0 mg L-1 de DCF em 25 dias. Foi observada liberação estequiométrica de cloreto. A identificação dos intermediários de biodegradação foi realizada. Uma possível via de degradação foi proposta com base na estrutura de 12 metabolitos identificados por (UPLC-QTOF/MS/MS). A libertação estequiométrica de cloreto e a não deteção de metabolitos no final das experiências, indicou a degradação completa do DCF pela estirpe F11. Um reator granular sequencial descontinuo de grânulos aeróbios (AGS-SBR) foi estabelecido a partir de lamas ativadas de uma ETAR e bioaumentado com a estirpe F11, e foi usado para o tratamento de um influente sintético contendo DCF. No geral, os principais processos biológicos, como remoção de carência química de oxigénio (CQO), e de nutrientes, azoto e fósforo, não foram afetados pela adição de DCF no fluxo de entrada a 10 mg L-1. Embora o AGS-SBR não tenha sido capaz de remover o DCF, mostrou-se robusto para manter as principais funções biológicas ao longo de 286 dias com diferentes condições testadas. Ao longo da operação, a dinâmica da comunidade microbiana foi monitorizada. Onze isolados bacterianos cultiváveis foram recuperados e testados para a biodegradação do DCF; a maior taxa de degradação obtida foi ca 34% de 10 mg L-1 DCF como única fonte de carbono. O AGS-SBR apresentou uma comunidade bacteriana diversificada, com alterações visíveis nas diferentes condições testadas. A estirpe F11 manteve-se presente durante toda a operação do reator, como demonstrado por sequenciação das bandas excisadas a partir do Gel de Eletroforese em Gradiente Desnaturante. A biodegradação de DCF pelos grânulos aeróbios foi testada em batch com alimentações periódicas com acetato, resultando em ca. 72% de remoção de 10.0 mg L-1 de DCF. A maior extensão de degradação dos grânulos comparativamente com a degradação obtida pelos isolados sugere que a estirpe F11 contribuiu para o processo