Proteomic and metabolomic study of wine yeasts during cava production

El vino espumoso elaborado por el método tradicional o Champenoise implica dos fermentaciones consecutivas. La primera fermentación es aquella en la que el mosto de uva se transforma en vino base y, tras su elaboración, tiene lugar la ‘toma de espuma’, durante la cual se desarrolla la segunda fermentación y la autolisis de las levaduras. Esta segunda fermentación consiste en el llenado de las botellas con vino base y el ‘licor de tiraje’, compuesto por levaduras, azúcar y bentonita, todo ello en botella cerrada. Este último proceso fermentativo se continúa con un período prolongado de envejecimiento del vino en contacto con las lías de levadura en una zona oscura y fresca de la bodega. Durante todo el proceso de elaboración del vino, las levaduras deben ser capaces de soportar numerosos factores de estrés, como un elevado contenido en etanol, falta de nutrientes, baja temperatura y sobrepresión de CO2 endógeno, entre otros. Las levaduras modifican su metabolismo celular según las condiciones ambientales, por lo que en el proceso de elaboración de cava se consigue mantener la viabilidad y asegurar su éxito. De este modo, una mejor comprensión del metabolismo de las levaduras, su adaptación y su comportamiento en las condiciones típicas de la segunda fermentación son necesarias para el proceso de selección de cepas y su aplicación en la industria del vino, y puede ser interesante para el control de la calidad y la mejora del proceso de vinificación. La influencia de las levaduras sobre las características organolépticas del vino es un factor biótico clave ya que, por un lado, éstas afectan a la calidad de la uva; y por otro, son capaces de producir gran cantidad de compuestos que contribuyen a estas características y, en definitiva, a su calidad. En general, el mayor porcentaje de la composición aromática total del vino está representado por compuestos volátiles derivados del metabolismo de las levaduras. Durante la fermentación, las levaduras producen etanol y dióxido de carbono, además de muchos otros metabolitos importantes, como son glicerol y ácido acético y cientos de compuestos aromáticos activos, entre los que se incluyen alcoholes superiores, ésteres, aldehídos, ácidos orgánicos, ácidos grasos volátiles y compuestos de carbonilo. Como consecuencia, cada cepa produce un perfil aromático fermentativo diferente de compuestos volátiles, incluso cuando se utilice el mismo mosto de uva. En esta Tesis Doctoral se ha estudiado el metabolismo celular de dos cepas de levadura industriales, Saccharomyces cerevisiae P29 y G1, durante la segunda fermentación en la elaboración de vino espumoso. La cepa P29 se usa convencionalmente en la elaboración de vinos espumosos procedente de la Denominación de Origen Vilafranca del Penedès (Barcelona, España), mientras que la cepa G1 es una levadura formadora de velo de flor responsable de la crianza biológica de los vinos finos de la Denominación de Origen Montilla-Moriles (Córdoba, España). El empleo de levaduras no convencionales se ha convertido en una tendencia actual muy interesante en la industria del vino. Debido a la capacidad de esta levadura para soportar altas concentraciones de etanol, el uso de una levadura de velo de flor para la elaboración de vino espumoso supone una novedosa ventaja para la industria del vino. Además, las cepas de levadura de velo de flor poseen características distintivas en comparación con otras cepas fermentativas de S. cerevisiae, como su capacidad para formar una biopelícula en la interfaz aire-líquido del vino. Estas propiedades adhesivas celulares permitirían a los enólogos eliminar fácilmente las levaduras y sedimentos en la “fase de degüelle” durante la elaboración del Cava por el método tradicional. Esto conlleva reducir los costes y el tiempo de producción, lo que implica un importante paso adelante en la industria del vino espumoso. Al mismo tiempo, mitiga la situación actual de baja diversidad de levaduras disponibles comercialmente para la elaboración de vinos espumosos por el método tradicional. Ambos tipos de cepas presentaron una cinética de fermentación similar. Sin embargo, mostraron diferencias en su metabolismo celular a nivel de proteoma. Estas diferencias son debidas a una adaptación de la cepa de velo de flor a condiciones nuevas de estrés. La respuesta proteómica de la cepa de levadura de flor a las condiciones típicas de segunda fermentación se caracterizó por un aumento en el número y contenido de las proteínas implicadas en la formación de compuestos derivados de la fermentación (etanol y glicerol); y un bajo contenido proteico en las proteínas involucradas con la formación de ésteres. Por otro lado, la respuesta metabolómica fue bastante similar en ambas cepas. Además, en la levadura flor, fue posible establecer un mayor número de correlaciones significativas entre ésteres y proteínas durante la segunda fermentación en botella. Por otra parte, el estudio global obtenido de procesos biológicos que tienen lugar durante la segunda fermentación en la levadura convencional mostró una mayor representación de procesos biológicos relacionados con la traducción de proteínas, probablemente en respuesta al estrés causado por las duras condiciones de fermentación. Los resultados obtenidos junto con las propiedades enológicas de capacidad de adhesión y de tolerancia a elevadas concentraciones de etanol, convierten a la cepa G1 en una candidata muy interesante para la mejora de la calidad y producción de los vinos espumosos.Sparkling wine made by the traditional method, also named Champenoise, involves two consecutive fermentations. It is in the first fermentation where the must is transformed into base wine and, after its elaboration, the “toma de espuma” takes place. During this stage, the second fermentation and the autolysis of the yeasts happen. This second fermentation consists of filling the bottles with base wine and the “tirage” liquor, composed of yeast, sugar and bentonite, all in a closed bottle. This last fermentation process is continued with a prolonged period of aging the wine in contact with the yeast lees in a dark and cool area of the cellar. Throughout the winemaking process, yeasts must be able to withstand numerous stress factors such as high ethanol content, lack of nutrients, low temperature and endogenous CO2 overpressure, among others. To maintain viability and ensure the success of this process, yeast modifies its cellular metabolism. Therefore, a better understanding of the yeast metabolism, its adaptation and its behavior in the typical conditions of the second fermentation are necessary for the process of strain selection and the improvement of its application in the wine industry. Furthermore, they can be interesting for the quality control and the improvement of the winemaking process. The influence of yeasts on the organoleptic characteristics of wine is a key biotic factor since, on the one hand, they affect the quality of the grape, and on the other, they are capable of producing a large number of compounds that contribute to these characteristics and, ultimately, to its quality. In general, the highest percentage of the total aromatic composition of wine is represented by volatile compounds derived from yeast metabolism. During fermentation, yeast produces ethanol and carbon dioxide, as well as many other important metabolites, such as glycerol, acetic acid and hundreds of active aromatic compounds, including higher alcohols, esters, aldehydes, organic acids, volatile fatty acids and carbonyl compounds. As a result, each strain produces a different fermentation aroma profile of volatile compounds, even when the same grape must is used. In this doctoral thesis, the cell metabolism of two industrial yeast strains, Saccharomyces cerevisiae P29 and G1, during the second fermentation in the production of sparkling wine has been studied. The P29 strain is conventionally used in the production of sparkling wines, while the G1 strain is a flor veil forming yeast responsible for the biological aging of fine wines from the Montilla-Moriles Denomination of Origin (Córdoba, Spain). The application of non-conventional yeasts has become a very interesting current trend in the wine industry. Due to the capability of this yeast to support high concentrations of ethanol, the use of a flor veil yeast for the production of sparkling wine is a new advantage for the wine industry. In addition, flor yeast strains possess distinctive characteristics compared to other S. cerevisiae fermentation strains, such as their ability to form a biofilm at the air-liquid interface of the wine. These cellular adhesive properties would allow winemakers to easily remove yeasts and sediments in the “degüelle” phase during the production of Cava by the traditional method. This will reduce costs and production time, which is a major step forward in the sparkling wine industry. At the same time, it mitigates the current situation of the low diversity of commercially available yeasts for the production of sparkling wines by the traditional method. Both types of strains had similar fermentation kinetics; however, they showed differences in their cell metabolism at the proteome level. These differences are due to an adaptation of the flor strain to new stress conditions. The proteomic response of the flor yeast strain to typical secondary fermentation conditions was characterized by an increase in the number and content of proteins involved in the formation of fermentation-derived compounds (ethanol and glycerol); and low protein content in the proteins involved in ester formation. One the other hand, the metabolomic response was quite similar in both strains. Furthermore, in the flor yeast, it was possible to establish a greater number of significant correlations between esters and proteins during the second fermentation in the bottle. On the other hand, the overall study obtained from biological processes taking place during the second fermentation in conventional yeast showed a greater representation of biological processes related to protein translation, probably in response to stress caused by the harsh fermentation conditions. The results obtained, together with the oenological properties of adhesion capability and tolerance to high concentrations of ethanol, make the G1 strain a very interesting candidate for improving the quality and production of sparkling wines