Prospecção proteômica de biomarcadores plasmáticos associados ao Diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2

Orientadora : Profª Drª Dayane AlbertonCoorientador : Prof. Dr. Geraldo PichethDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa : Curitiba, 02/03/2018Inclui referências : p. 66-84Resumo : O diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica de incidência mundial caracterizado por um quadro hiperglicêmico resultante da deficiência na síntese da insulina, ação, ou em ambos. O diagnóstico precoce do diabetes, atrelado ao adequado tratamento e monitoramento, permite minimizar e postergar o aparecimento das complicações associadas (nefropatia, retinopatia, doença cardiovascular, entre outras). Desta forma, faz-se necessário a busca de novos biomarcadores para o diagnóstico, prognóstico e monitoramento da doença. Portanto, o objetivo deste trabalho foi a avaliação da expressão diferencial de proteínas plasmáticas por análise proteômica comparativa em pacientes DM1 e DM2 com mau e bom controle glicêmico e indivíduos controle. Para a remoção das proteínas mais abundantes do plasma, duas técnicas de extração foram testadas: kit comercial Proteome PurifyTM 2 e acetona 50% (v/v). Após esses tratamentos as proteínas plasmáticas foram separadas por eletroforese 1D SDS-PAGE 10%, analisadas por densitometria e identificadas por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF. Para o tratamento com o kit Proteome PurifyTM 2, 16 bandas proteicas foram visualizadas no gel para ambos os grupos DM1 e DM2, e 4 bandas proteicas identificadas como a-2-macroglobulina (a-2-M), ceruloplasmina (Cp), haptoglobina (Hp) e apolipoproteína A-I (ApoA-I) apresentaram volumes relativos maiores e estatisticamente significativos em relação ao grupo controle. A proteína a-2-M, nos subgrupos DM1 com mau e bom controle glicêmico e no subgrupo DM2 com mau controle glicêmico, apresentou um volume relativo maior e com significância estatística quando comparado ao grupo controle. A expressão da proteína Cp nos subgrupos DM1 e DM2 com mau e bom controle glicêmico foi maior e com significância estatística em relação ao grupo controle e, ao comparar os subgrupos, a expressão da Cp foi superior no subgrupo DM1 com mau controle glicêmico em relação ao subgrupo DM1 com bom controle glicêmico. A proteína plasmática Hp foi identificada em duas bandas proteicas diferentes nos grupos em estudo e a expressão de Hp, considerando ambas as bandas, foi superior nos subgrupos DM1 e DM2 com mau controle glicêmico em relação ao grupo DM1 e DM2 com bom controle glicêmico e ao grupo controle. Já a proteína apoA-I apresentou aumento de expressão com significância estatística apenas nos subgrupos DM1 com mau e bom controle glicêmico em relação ao grupo controle. No tratamento com acetona 50% (v/v), 12 bandas foram visualizadas no gel 1D para os grupos em estudo, mas apenas as bandas referentes à Cp e Hp apresentaram diferença de expressão entre os grupos. A expressão da proteína Cp nos subgrupos DM1 e DM2 com mau e bom controle glicêmico foi maior e com significância estatística em relação ao grupo controle e, ao comparar os subgrupos, a expressão da Cp foi superior no subgrupo DM2 com mau controle glicêmico em relação ao subgrupo DM2 com bom controle glicêmico. A expressão da Hp foi superior nos subgrupos DM1 com mau e bom controle glicêmico e no subgrupo DM2 com mau controle glicêmico em relação ao grupo controle. Portanto, é possível inferir que os pacientes portadores de DM1 e DM2 com mau e bom controle glicêmico apresentam um quadro inflamatório subclínico devido à maior expressão de proteínas de fase aguda positiva de processo inflamatório. Palavras chave: Diabetes Mellitus, a-2-macroglobulina, Ceruloplasmina, Haptoglobina, Apolipoproteína A-I, Estudo ProteômicoAbstract : Diabetes mellitus (DM) is a chronic disease of global incidence characterized by a hyperglycemic resulting from deficiency in insulin synthesis, action, or both. The early diagnosis of diabetes, coupled with the adequate treatment and monitoring, allows minimizing and delaying the appearance of associated complications (nephropathy, retinopathy, cardiovascular disease, among others), improving the quality of life of those affected and reducing the costs of the public health system. Thus, it is necessary to search for new biomarkers for the diagnosis, prognosis and monitoring of the disease. Therefore, the objective of this work was the evaluation of the differential expression of plasma proteins by comparative proteomic analysis in DM1 and DM2 patients with poor and good glycemic control and control subjects. For the removal of the most abundant proteins from plasma, two extraction techniques weretested: Proteome PurifyTM 2 commercial kit and 50% (v/ v) acetone. After these treatments, the plasma proteins were separated by 10% SDS-PAGE 1D electrophoresis, analyzed by densitometry and identified by MALDI-TOF type mass spectrometry. For the treatment with the Proteome Purify kit, 16 protein bands were visualized on the gel for both DM1 and DM2 groups, and 4 protein bands identified as a-2-macroglobulin (a-2- M), ceruloplasmin (Cp), haptoglobin (Hp) and apolipoprotein AI (ApoA-I) presenting higher and statistically significant relative volumes in relation to the control group. The a-2-M protein in the DM1 subgroups with poor and good glycemic control and in the DM2 subgroup with poor glycemic control had a higher relative volume and with statistical significance when compared to the control group. The expression of Cp protein in the DM1 and DM2 subgroups with poor and good glycemic control was higher and statistically significant in relation to the control group, and when comparing the subgroups, the expression of Cp was superior in the DM1 subgroup with poor glycemic control compared to subgroup DM1 with good glycemic control. The Hp plasma protein was identified in two different protein bands in the study groups and considering both bands, Hp expression was higher in the DM1 and DM2 subgroups with poor glycemic control compared to the DM1 and DM2 groups with good glycemic control and group control. The apoA-I protein presented expression increased and with statistical significance only in DM1 subgroups with poor and good glycemic control in relation to the control group. In the 50% (v/v) acetone treatment, 12 bands were visualized on the 1D gel for study groups and only the protein bands of the Cp and Hp presented higher and statistically significant relative volumes in DM1 and DM2 groups in relation to the control group. The expression of Cp protein in the DM1 and DM2 subgroups with poor and good glycemic control was higher and statistically significant in relation to the control group and, when comparing the subgroups, the expression of Cp was superior in the DM2 subgroup with poor glycemic control in relation to the subgroup with good glycemic control. The expression of Hp was superior in the DM1 subgroups with poor and good glycemic control and in the DM2 subgroup with poor glycemic control compared to the control group. Therefore, it is possible to infer that patients with DM1 and DM2 with poor and good glycemic control present a subclinical inflammatory due to the greater expression of positive acute phase proteins of inflammatory process. Keywords: Diabetes Mellitus, a-2-macroglobulin, Ceruloplasmin, Haptoglobin, Apolipoprotein A-I, Proteomic Stud