Evaluation of the Cannabidiol effects under neuroimmunoendocrine and behavioral alterations induced by stress in mice

Diversas evidências sugerem o envolvimento de citocinas pró-inflamatórias em pacientes psiquiátricos e modelos animais de transtornos mentais. Interleucina-1β (IL-1β), amplamente descrita como agente neuroinflamatório, apresenta-se elevada em pacientes depressivos, ansiosos e com transtorno de estresse pós-traumático (PTSD). A via de NFkB e o inflamassoma de NLRP3 medeiam a transcrição e função de IL-1β, induzindo a ativação do sistema imune inato e inflamação. A ativação deste complexo tem sido amplamente relacionada à transtornos mentais. O canabidiol (CBD) possui inúmeros efeitos terapêuticos já descritos. Entretanto, a interação entre CBD e sistema imunológico, além do envolvimento de mecanismos imunológicos sobre os efeitos comportamentais da droga, ainda são pouco conhecidos. Desse modo, este trabalho objetivou avaliar o envolvimento do inflamassoma de NLRP3 no mecanismo pelo qual o CBD previne ou reverte alterações comportamentais e neuroimunoendócrinas em modelos animais. Para isso, machos C57BL/6 adultos foram expostos aos protocolos: estresse crônico imprevisível (21 dias), estresse por restrição (6h) ou 2 choques inescapáveis nas patas (1,5mA). Adicionalmente, usou-se modelo animal de ansiedade baseado no acasalamento seletivo. Os resultados obtidos através do modelo de estresse crônico imprevisível evidenciaram que os animais estressados apresentam redução do peso corpóreo, aumento do tempo de imobilidade no teste do nado forçado e hipolocomoção no teste do campo aberto em comparação com animais controle. Entretanto, no teste de supressão da alimentação pela novidade, os animais não apresentavam a supressão da alimentação apenas pela neofobia, mas sim de modo geral. O teste de preferência pela sacarose não nos forneceu dados robustos. O CBD não alterou os efeitos comportamentais do estresse. Diante da baixa reprodutibilidade dos resultados obtidos com este modelo, decidimos utilizar o modelo de estresse por restrição por 6 horas. Esse modelo diminuiu o tempo de permanência e o número de entradas nos braços abertos do labirinto em cruz elevado (LCE) 24 h e 7 dias após o estresse. Não houveram alterações no teste de suspensão pela cauda e peso corpóreo. O tratamento repetido com o CBD 30 mg/kg preveniu o estabelecimento das consequências comportamentais do estresse nos animais estressados, porém induziu efeito tipo-ansiogênico per se nos animais não estressados. Durante o doutorado sanduíche, foram utilizados camundongos com comportamentos extremos relacionados a ansiedade de modo inato (HAB) e seus respectivos controles (NAB). Os animais HAB apresentaram comportamentos relacionados à ansiedade no teste do LCE e beetle mania task quando comparados aos NAB. No teste de medo condicionado ao som, os animais HAB são capazes de extinguir a memória aversiva, porém não são capazes de consolidar a extinção e possuem recuperação espontânea das respostas de medo, quando comparados aos animais NAB. O tratamento com o CBD (15 e 30 mg/kg) não induziu alterações em comparação com o grupo veículo nos animais HAB em nenhum dos testes utilizados. Diante da ausência de efeitos agudos do CBD, decidimos trocar para um modelo animal de PTSD. Três semanas após o trauma, o tratamento diário teve início: veículo ou CBD (10 a 30 mg/kg, 1 injeção i.p.). Depois de uma semana de tratamento, os animais foram testados para generalização e efeitos de longa duração dos choques e, 24 horas depois, os animais foram testados para expressão e recuperação do medo. O estresse aumentou o tempo de congelamento e diminuir o número de rearings em ambos os testes. O tratamento repetido com o CBD não reverteu as alterações induzidas pelo modelo. Não houve efeito do estresse e/ou do tratamento nos animais submetidos ao trauma e testados no beetle mania task. Em geral, as inúmeras limitações enfrentadas dificultaram o andamento do projeto. Os resultados obtidos com o modelo de estresse único por restrição evidenciam que esse protocolo induz alterações que viabilizam estudos pré-clínicos de transtorno mentais e que o tratamento repetido com o CBD, na dose de 30 mg/kg, induz um efeito dual que depende da condição prévia de estresse do animal. Já os estudos com a linhagem HAB evidenciam que esses animais possuem o fenótipo relacionado à ansiedade de modo inato, porém que o CBD não possui efeito agudo nesses animais. Por fim, o modelo animal de PTSD, induziu alterações comportamentais robustas e duradouras. Apesar de o CBD não alterar os efeitos do estresse, este resultado pode sugerir que este fitocanabinoide não seja efetivo em pacientes com o quadro de TEPT já estabelecido após um longo período do trauma; uma vez que estudos prévios de nosso grupo e de outros grupos evidenciaram que o composto pode prevenir as consequências comportamentais em outros modelos animais de TEPT, quando administrado logo após o trauma ou após um novo estresse - reminder.Several pieces of evidence suggest the involvement of proinflammatory cytokines in psychiatric patients as well as in animal models of mental disorders. Interleukin-1β (IL- 1β) levels, widely described as neuroinflammatory agent, is increased in patients with depression, anxiety and post-traumatic stress disorder (PTSD). NFkB and NLRP3 inflammasome pathway mediate IL-1β transcription and function. The activation of this complex has been related to mental disorders. Cannabidiol (CBD) has several therapeutical effects already described. However, the interaction between CBD and immune system, as well as the involvement of immunological mechanisms mediating behavioral effects of this drug, are still poorly understood. This work aimed to evaluate the involvement of NLRP3 inflammasome pathway on the mechanisms by which CBD can prevent of reverse behavioral and neuroimmunoendocrine alterations in animal models. Adult male C57Bl/6 mice were exposed to the following protocols: chronic unpredictable stress (CUS; 21 days), restraint stress (RS; 6h) or 2 inescapable foot shocks (PTSD; 1.5mA). Additionally, an animal model of anxiety, based on selective breeding, was used. Results obtained with CUS model showed a reduction on the body weight, increase in immobility time on the forced swim test as well as hipolocomotion on the open field test of stressed mice in comparison with control. However, on the novelty suppressed feeding test, animals showed that the feeding was generally suppressed and not just by neophobia. Sucrose preference test wasn\'t able to give us reliable results. CBD wasn\'t able to alter behavioral effects induced by stress. Considering the low reproducibility of the results obtained with this model, we decided to use RS. Six hours of RS decreased the time spent and number of entries in the open arms of the elevated plus maze (EPM) 24h and 7 days after stress. There were no changes on the tail suspension test and body weight. Repeated treatment with CBD (30 mg/kg) prevents behavioral consequences of stress in stressed mice, despite induced an anxiogenic-like effect per se in controls. During the abroad internship in Germany, we used mice with high-anxiety trait (HAB) and their respective controls (NAB). HAB mice showed an increase in anxiety related behaviors in the EPM and beetle mania task when compared to NAB. In the auditory fear conditioning test, HAB mice did extinguish aversive memory, however were not able to consolidate extinction memory and spontaneously recovered fear responses when compared to NAB. CBD treatment (15 and 30 mg/kg) did not show any improvement in comparison with vehicle in HAB mice. In the absence of acute CBD effects, we decided to use an animal model of PTSD. Three weeks after the trauma, daily treatment with vehicle or CBD (10-30 mg/kg, 1 injection i.p.) started. After one week of treatment, animals were tested for generalization and long-lasting consequences of shocks. Twenty for hours later, mice were tested for fear expression and recovery. Stress increased freezing time and decreased number of rearings in both tests. Repeated treatment with CBD did not revert the alterations induced by this model. In the same way, there was no effect of stress and/or treatment of mice submitted to trauma and tested in the beetle mania task. In general, the difficulties faced hindered the progress of the project. Results obtained with CUS suggest that this protocol induce changes that makes possible preclinical studies of mental disorders and that repeated treatment with CBD, 30 mg/kg, induce a dual effect that depends on the previous stress condition of the animal. The experiment with HAB lineage evidence that these mice did present innate anxiety-related phenotype, despite CBD had no acute effect. Finally, PTSD model is able to induce robust and long-lasting behavioral alterations in mice. Although CBD wasn\'t able to ameliorate these stress\' effects, this result can suggest that this phytocannabinoid is not effective in patients with PTSD already installed after a long period of trauma; since previous studies by our and other groups have shown that the compound can prevent behavioral consequences in other animal models of PTSD, when administered shorly after the trauma or a new stressor - reminder