Produção e caracterização de novas lipases imobilizadas para utilização em biocatálise

Orientador : Profª. Drª. Nadia KriegerTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 29/03/2017Inclui referências ao final de cada capítuloResumo: Este trabalho teve como objetivo geral a produção, imobilização e caracterização das lipases LipC12 e LipBC visando futuras aplicações em biocatálise. Para obtenção da lipase LipBC, os genes lipA e lipB que codificam para lipase (LipBC) e foldase (LifBC), respectivamente, foram identificados no genoma da bactéria Burkholderia contaminans LTEB11, e clonados em vetores de expressão. As proteínas LipBC e LifBC foram expressas, purificadas e ensaios de caracterização foram realizados. LipBC e LifBC apresentam massas moleculares correspondentes a 33 kDa e 37 kDa, respectivamente, e permanecem complexadas após a purificação. LipBC livre apresenta alta atividade específica para substratos de cadeia curta (tributirina, 1400 U mg-1) e longa (óleo de oliva, 845 U mg-1), além de atividade e estabilidade em uma ampla faixa de pH (6,5 - 10) e temperatura (25 - 45 °C). LipBC foi imobilizada no suporte Sepabeads e apresentou atividade de esterificação (4 U g-1) quando aplicada na síntese de oleato de etila em n-hexano, com 90% de conversão em 6 h. Este trabalho também teve por objetivo a síntese de novos suportes para imobilização de lipases, assim como o desenvolvimento de novos protocolos de imobilização. Novos suportes bifuncionais foram preparados a partir de agarose e a lipase LipC12 foi utilizada como modelo de estudo. Os novos suportes apresentam grupos hidrofóbicos (diferentes grupos alquila) para promover a adsorção da lipase e grupos aldeídos para promover ligações covalentes com a enzima adsorvida. A melhor preparação imobilizada, C12-aldeído-LipC12, apresentou uma hiperativação acima de 300% e um aumento significativo na estabilidade (5000 vezes) a 80 °C em comparação com a enzima livre. C12-aldeído-LipC12 foi aplicada com sucesso na hidrólise regiosseletiva do substrato peracetilado D-glucal, apresentando 69% de conversão do produto C-3 mono-desacetilado após 96 h. As diferentes estratégias de imobilização propostas nesse trabalho podem ser aplicadas em materiais como celulose, sílica ou resinas acrílicas, o que permite a obtenção de novos biocatalisadores com alta atividade e estabilidade para a aplicação em diferentes sistemas reacionais em biocatálise. Palavras-chave: Imobilização, lipases, hiperativação, agarose, novos suportes, regiosseletividade, biocatálise.Abstract: This work aimed the production, immobilization and characterization of the lipases LipC12 and LipBC for future applications in biocatalysis. To obtain the LipBC lipase, lipA and lipB genes encoding lipase (LipBC) and foldase (LifBC), respectively, were identified in the genome of the bacterium Burkholderia contaminans LTEB11. The genes were amplified and cloned into expression vectors. LipBC and LifBC proteins were expressed, purified and characterization assays were performed. LipBC and LifBC have molecular weights corresponding to 33 kDa and 37 kDa, respectively, and remained complexed after purification. LipBC has high specific activity against short (tributyrin, 1400 U mg-1) and long chain substrates (olive oil, 845 U mg-1), as well as activity and stability over a wide range of pH (6.5 - 10) and temperature (25 - 45 °C). LipBC was immobilized on Sepabeads and 90% of efficiency of immobilization was obtained in 1 h. The immobilized preparation catalyzed the synthesis of ethyl-oleate with an activity of 4 U g-1, with a yield of 90% obtained in 6 h. This work also aimed the synthesis of novel supports for lipase immobilization, as well as the development of new immobilization protocols. New bifunctional supports were prepared and LipC12 lipase was used as the study model. The new supports contained hydrophobic groups (different alkyl groups) to promote interfacial adsorption of the lipase and aldehyde groups to react covalently with the amino groups of side chains of the adsorbed lipase. The best immobilized preparation, C12-aldehyde-LipC12 was 3.5-fold more active (hyperactivation) and 5000-fold more stable (at 80 °C ) than the soluble enzyme. C12-aldehyde-LipC12 was successfully applied in the regioselective hydrolysis of peracetylated D-glucal, producing high yields (69%) of the C-3 monodeacetylated product after 96 h of reaction. The different strategies of immobilization proposed in this work can be applied in materials such as cellulose, silica or acrylic resins, which allows the production of new biocatalysts with high activity and stability for the application in biocatalysis. Key-words: Immobilization, lipases, hyperactivation, agarose, new supports, glutaraldehyde, regioselectivity, biocatalysis