Examination of biofilm formation of staphylococcus aureus strains isolated from wound with conventional and molecular methods

Bu çalışmada ile Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvar'ında yara yerinden izole S.aureus suşlarının biyofilm yapma yetenekleri, biyofilm oluşumu ile ilişkili genlerin ve yüzey proteinleri ile ilişkili genlerin varlığının araştırılması, biyofilm pozitif ve negatif suşların fenotipik ve genotipik karakterlerinin karşılaştırılması amaçlanmıştır. Çalışmaya yara yerinden izole edilen 50 S.aureus bakterisi dahil edilmiştir. Çalışmada biyofilm oluşumu konvansiyonel yöntem olarak kongo kırmızılı agar besiyeri ve mikrotitrasyon plak yöntemi kullanılarak karşılaştırılmıştır. Kongo kırmızılı agar besiyerine ekilen 50 S.aureus suşunun 37oC'de bir gece ve sonrasında oda ısısnda 48 saat inkübasyon sonucunda yapılan koloni morfolojisine dayanan fenotipik değerlendirmede 16 (%32) örneğin biyofilm oluşumunu negatif bulunurken 34 (%68) örneğin biyofilm oluşumu pozitif olarak bulunmuştur. Mikrotitrasyon plağı yönteminde; 37oC'de 24 saatlik inkibasyonun ardından kristal viyole ile boyama sonrasında absorbans ölçümleri yapılarak tüm suşların biyofilm oluşumu değerlendirilmiştir. Kristal viyole kullanılarak yapılan absorbans ölçümlerine göre yara yeri örneklerinin 17'sinde (%34) zayıf biyofilm oluşumu (negatif), 21'inde (%42) orta derece biyofilm oluşumu ve 12'sinde (%24) güçlü biyofilm oluşumu olduğu belirlenmiştir. Kongo kırmızılı agar besiyeri ve mikrotitrasyon plak yöntemi biyofilm oluşumu yönünden karşılaştırıldığında istatiksel olarak uyumluluk bulunmamıştır (p 0.05) . 77 S.aureus bakterisinin biyofilm oluşumunun moleküler olarak değerlendirmesinde; biyofilm oluşumunun ilk basamağında görev yapan yüzey proteinleri genlerinin varlığı (fnbA, clfA ve ebpS) ve ikinci basamakta hücre-hücre adezyonu ve çok tabakalı biyofilm oluşumunun şekillenmesinde görev alan icaA ve icaD genleri araştırılmıştır. Çalışmamızda yara yerinden izole edilen 50 S.aureus bakterisinin 44'ünde (%88) fnbA ve clfA geni saptanırken 6 (%12) suşta fnbA ve clfA geninin varlığı saptanılamamıştır. ebpS geni 23 (%46) suşta saptanırken 17(%34) suşta saptanılamamıştır. Kongo kırmızılı agar besiyerinde değerlendirilen biyofilm üretimi ile fnbA, clfA genleri arasında normal-orta derecede ilişki bulunurken (r=0.274, p0.001). Mikrotitrasyon plağı yönteminde değerlendirilen biyofilm üretimi ile fnbA geni arasında zayıf derecede (r=0.039 p>0.001), clfA geni arasında zayıf derecede (r=0.028 p>0.001) ve ebpS geni arasında negatif yönlü zayıf (r=-0.148 p>0.001) bir ilişki bulunmuştur. Çalışmamızda yara yerinden izole edilen 50 S.aureus bakterisinin 42'sinde (%84) ve pozitif kontrol olarak kullanılan S.aureus ATCC 43300 suşunda icaA ve icaD genlerinin her ikiside saptanmıştır. Çalışmaya alınan 50 suşun 7'sinde (%14) ve negatif kontrol olarak kullanılan S.aureus ATCC 29213 icaA ve icaD genleri saptanamadı. Çalışmaya katılan 1 (%2) suşda icaA pozitif, icaD geni ise negatif olarak saptanmıştır. Kongo kırmızlı agar besiyerinde değerlendirilen biyofilm oluşumu ile icaA ve icaD genleri arasında normal-orta derecede ilişkili bulunmuştur (r=0.285, p=0.001). Mikrotitrasyon plağı yönteminde değerlendirilen biyofilm oluşumu ile icaA ve icaD genleri arasında zayıf bir korelasyon saptanmıştır (r=0.088 p>0.001). Sonuç olarak; S.aureus biyofilm oluşumunda değerlendirilmesinde kullanılan konvansiyonel yöntemler arasında standardizasyon saptanılamamıştır. Yapılan moleküler değerlendirme sonucunda S.aureus'un biyofilm oluşumu ile sorumlu tutulan (fnbA, clfA, icaA ve icaD) genlerin biyofilm ile ilişkisi olduğu ve ebpS ile negatif yönlü bir ilişkinin bulunduğu ancak biyofilm oluşumunun tek başına genotipik özelliklere bağlı olmadığı, çevresel ve suşa ait özelliklerin de biyofilm oluşum mekanizmalarını etkilediği düşünülmektedir.This study is intended to analyze the ability of the S.aureus strains isolated from wounds to make biofilm, to assess the presence of the genes related to the biofilm formation and the genes related to surface proteins, and to compare the phenotypic and genotypic characters of the biofilm positive and negative strains at the Microbiology and Clinical Microbiology Laboratory of Gazi University Faculty of Medicine. A total of 50 S.aureus bacteria isolated from wounds were included to the study. In the study, Congo Red Agar and microplate assay method were used to compare the biofilm formation. According to the phenotypic assessment of colony morphology of 50 strains at Congo Red Agar, which was conducted after they were incubated at 37 oC for one night and then at room temperature for 48 hours, the biofilm production of 16 (32%) of the strains was found negative, while that of 34 (68%) strains was found positive. In microplate method, after the 24-hour incubation at 37 oC, absorbance measurements were evaluated after they were painted by using crystal violet, and then the biofilm production of all the strains was assessed. According to the absorbance measurements related to using crystal violet, 17 (34%) strains were negative, 21 (42%) were moderate and 12 (24%) were strong in terms of biofilm production. There was found no statistical relationship between microplate method and Congo Red Agar in terms of biofilm formation, upon their comparison. In the molecular evaluation of the biofilm formation of S.aureus bacteria, the existence of surface proteins genes (fnbA, clfA ve ebpS) that has role in the first step of biofilm formation was analyzed as well as the icaA and icaD genes that has role in the cell-cell adhesion and multi-layered biofilm formation. In our study, fnbA and clfA genes were detected in 44 (88%) of 50 S.aureus bacteria isolated from wounds while fnbA and clfA genes were not detected in 6 (12%) strains. Also ebpS genes were detected in 23 (46%) strains and were not detected in 17 (34%) strains. There was a normal-to-moderate relation between fnbA and clfA genes and the biofilm formation examined on Congo Red Agar (r=0.274, p0.001). Moreover, there was a poor relation between fnbA gene and biofilm formation examined with the microplate method (r=0.039, p>0.001). There was a poor relation between the biofilm formation and clfA gene (r=0.028, p>0.001) and a negative relation between the biofilm formation and ebpS gene (r=0.148, p>0.001). In our study, both icaA and icaD genes were determined in 42 (84%) strains of 50 S.aureus bacteria isolated from wounds and in S.aureus ATCC 43300 used positively. Neither icaA nor icaD genes were determined in 7 (14%) strains of 50 S.aureus bacteria included in the study and in S.aureus ATCC 43300 used negatively. In one strain (2%) included in the study, icaA gene was found as positive and icaD gene was found as negative. There was a normal-to-moderate relationship between icaA and icaD genes and the biofilm formation examined on Congo Red Agar (r=0.285, p=0.001). However, a poor correlation was determined between biofilm formation with the microplate method and icaA and icaD genes existence (r=0.088, p>0.001). 81 As a result, no standardization was determined among the conventional methods used in the evaluation of S. aureus biofilm formation. The result of molecular evaluations showed that the genes (fnbA, clfA, icaA ve icaD) was found to be responsible for the biofilm formation of S.aureus have something to do with the biofilm and have a negative relationship with ebpS gene. These results also indicate that biofilm formation does not depend only on genotypic features, but its mechanisms are also affected by the environmental features