Folate production of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus species isolated from yogurt made by traditional methods

Bu çalışmada, zengin folat içerikli yoğurt yapımında starter kültür olarak kullanılabilmesi amacı ile Türkiye'nin çeşitli ilçelerinden alınmış geleneksel yöntemlerle yapılan yoğurtlardan Lactobacillus (33) ve Streptococcus (34) cinslerine ait 67 bakteri izole edilmiştir. İzole edilen bakterilerin API 50 CH kiti ile biyokimyasal tanımlaması yapılmıştır. Ayrıca, biyokimyasal tanımlaması yapılan bakterilerden 6 streptokok ve 6 laktobasil izolatı tesadüfen seçilerek 16 S rDNA gen bölgesi ile moleküler olarak tanımlanmışlardır. Bakterilerin intrasellüler ve ekstrasellüler folat üretimleri üç farklı besiyerinde (Laktobasiller için; MRS (Man-Ragosa-Sharp), FACM (Folic acid casei medium), Skimmilk; Streptokoklar için, Elliker, FACM ve Skimmilk) ve üç farklı tampon uygulamasında (potasyum fosfat, sodyum fosfat ve sodyum asetat tamponu) belirlenmiştir. MRS besiyerinde potasyum fosfat tamponu uygulamasında, L. delbrueckii subsp. bulgaricus ZN951 suşu 126,3 μg/L değeri ile en yüksek intrasellüler folat üretimine sahip olduğu tespit edilirken, L. delbrueckii subsp. bulgaricus ZN541 suşu aynı besiyeri ve tamponda en yüksek ekstrasellüler folat üretimi (105,1 μg/L) göstermiştir. S. thermophilus türleri arasında ise en yüksek intrasellüler ve ekstrasellüler folat üretimi Z151 suşunda sırasıyla 177,1 μg/L ve 86,4 μg/L değerleri Elliker besiyerinde potasyum fosfat uygulamasında ölçülmüştür. İntrasellüler ve ekstrasellüler folat üretimleri yüksek çıkan L. delbrueckii subsp. bulgaricus ZN541 ve ZN951 ile S. thermophilus Z151 ve Z1052 suşlarının yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) analizi ile folat türevleri (Tetrahidrofolat (THF), 5-metil-THF, ve 5-formil-THF) ve pABA ihtiva edip etmedikleri araştırılmış ve mevcut maddelerin miktar tayini yaptırılmıştır. L. delbrueckii subsp. bulgaricus ZN541 ve ZN951 suşlarında folat türevleri hem intrasellüler hem de ekstrasellüler içerikte bulunmuştur. S. thermophilus Z151 suşunun ekstrasellüler içeriğinde yalnızca 5-formil-THF, intrasellüler içeriğinde tüm folat türevleri tespit edilmiştir. S. thermophilus Z1052 suşunda intrasellüler ve ekstrasellüler içerikte ise 5-metil-THF ve 5-formil-THF belirlenmiştir. Ancak suşların hiçbirinde pABA'ya rastlanılmamıştır. HPLC analizi ile çalışılan suşlardan L. delbrueckii subsp. bulgaricus ZN951 suşunun 110,5 μg/L değeri ile en yüksek total folat miktarına sahip olduğu belirlenmiştir. Ayrıca en yüksek folat türevleri içeriği olduğu belirlenen L. delbrueckii subsp. bulgaricus ZN541 ve ZN951 suşlarında polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile folat metabolizmasında kilit enzim olan dihidrofolat redüktaz (EC 1.5.1.3) (DHFR) gen bölgesi (folA geni) araştırılmış ve her iki suşta da gen bölgesi tespit edilmiştir.In this study, 67 bacteria have been isolated pertaining to Lactobacillus (33) and Streptococcus (34) genus which have been derived from different yogurts made by traditional methods in various districts of Turkey, in order to make them used as starter culture for making yogurt rich in folate. The biochemical identification of these isolated bacteria has been done via API 50 CH kit. Besides, 6 streptococci and 6 lactobacilli strains, which were selected randomly from the bacteria which were identified biochemically, have been defined molecularly with 16 S rDNA regions. Intracellular and extracellular folate production of bacteria have been determined in three different medium (for lactobacilli; MRS (Man-Ragosa-Sharp), FACM (Folic acid casei medium), Skimmilk; for streptococci; Elliker, FACM and Skimmilk) and during three different buffer implementation (potassium phosphate, sodium phosphate and sodium acetate buffer). During potassium phosphate buffer implementation in MRS broth, it has been seen that L. delbrueckii subsp. bulgaricus ZN951 strain has the highest production of intracellular folate with the value of 126,3 μg/L while L. delbrueckii subsp. bulgaricus ZN541 strain has the highest production of extracellular folate with the value of 105,1 μg/L. Among the S. thermophilus species, the highest intracellular and extracellular folate productions of Z151 strain have been measured respectively the values of 177,1 μg/L and 86,4 μg/L during potassium phosphate buffer implementation in Elliker broth. It has been examined whether L. delbrueckii ssp. bulgaricus ZN541 and ZN951 and S. thermophilus Z151 and Z1052 strains contain folate derivatives (THF (tetrahydrofolate), 5-methyl-THF and 5-formyl-THF) and pABA or not by analyzing them according to high performance liquid chromatography (HPLC) of these strains. In addition, doses of these substances have been determined. The folate derivatives of L. delbrueckii ssp. bulgaricus ZN541 and ZN951 strains have been found both in intracellular and extracellular content. Only 5-formyl-THF has been detected in the extracellular content of S. thermophilus Z151 strain while all folate derivatives have been found in its intracellular content. 5-methyl-THF and 5-formyl-THF have been found in the intracellular and extracellular content of S. thermophilus Z1052 strain. However, there is no pABA in these strains. It has been seen that L. delbrueckii subsp. bulgaricus ZN951, which has been studied with HPLC analysis, has the highest total amount of folate with the value of 110, 5 μg/L. On the other hand, dihydrofolate reductase (EC 1.5.1.3) (DHFR) gene region (folA gene), which is the key enzyme in folate metabolism, has been studied by means of polymerase chain reaction (PCR) in L. delbrueckii ssp. bulgaricus ZN541 and ZN951 strains. As a result, a gene region has been detected in both strains