Engineering of core Pentose Metabolism in Saccharomyces cerevisiae for Bio-ethanol Production

Tese de Doutoramento em Ciências (Especialidade em Biologia)Renewable fuels that do not contribute to atmospheric carbon dioxide have gained increased attention due to peak oil and the possibility of carbon dioxide induced climate change. Bioethanol is the currently largest biofuel in terms of annual production and is mainly produce by fermentation of hexose sugars in sucrose or starch from sugarcane or corn by the yeast Saccharomyces cerevisiae. Second generation biofuel is based on a low value carbon source and production costs are sensitive to ethanol yield. One obvious way to improve yield would be to also ferment the pentose sugars such as D-xylose and L-arabinose from the hemicellulose fraction of the biomass. S. cerevisiae does not naturally ferment D-xylose and L-arabinose, but can be made to do it by metabolic engineering with heterologous genes from yeasts, fungi or bacteria. Aerobic growth on D-xylose requires the expression of xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase (XDH) or xylose isomerase, both resulting in the conversion of D xylose to D-xylulose. Further efficient D-xylose catabolism to ethanol requires the overproduction of D-xylulose kinase and genes encoding pentose phosphate pathway enzymes. Initial L-arabinose metabolism requires on the other hand, the expression of the three genes in the bacterial AraBAD operon or two fungal L-arabinitol-4 dehydrogenase, L-xylulose-reductase. The number of metabolic engineering target genes for efficient pentose fermentation has increased to about ten or more, making the classic expression of genes, one by one, using plasmid vectors or genetic integration an impractical strategy. In this thesis, a new pathway assembly tool that allows the simultaneous expression of at least eight genes was developed and named The Yeast Pathway Kit (YPK). This tool has several advantages over alternative pathway assembly protocols, notably that it allows reuse of genetic elements and both rational and random assembly of pathway components. We used the YPK to construct several yeast strains expressing the initial D xylose metabolism (XR and XDH) from the D-xylose utilising yeast Scheffersomyces stipitis together with overexpression of D-xylulose kinase (XKS1) and transaldolase (TAL1), four genes in total. A pathway additionally expressing D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase (RPE1), Ribose-5-phosphate ketol-isomerase (RKI1) and Transketolase (TKL1) and the Candida intermedia GXF1 D-xylose transporter was also constructed, resulting in an eight gene pathway. A rationally designed four gene pathway enabled an aerobic growth rate of 0.21 h-1, which is the highest reported to date, possibly because all participating genes are present on a multicopy construct, in contrast with previously described strains where all or a part of the pathways were integrated into the genome in one or a few copies. Overexpressing the additional four genes in the eight gene pathway did not further increase growth rate, but led to fermentation with higher ethanol and lower xylitol yields. The manual planning of assembly of large metabolic pathways using DNA editor software is an error prone and time consuming task that is also difficult to properly document. We therefore developed a software package that allows the simulation of the molecular biology unit operations involved in the assembly of metabolic pathways using the YPK. An assembly protocol is expressed in a scripting language that allows the simulation of the assembly and also serves as a verifiable documentation of the experiment. A key metabolic step for effective L-arabinose and D-xylose metabolism is the initial transport into the cell. A number of fungal L-arabinose and D-xylose transporters have been identified and used in metabolic engineering for more efficient catabolism of these sugars. Transporters found by classical biochemistry or functional screening with recombinant pentose utilizing S. cerevisiae have identified transporters with poor kinetics when expressed in S. cerevisiae. Therefore, we have also developed a novel functional screening strain based on the glucose negative phenotype of the S. cerevisiae phosphoglucose isomerase (pgi1) mutant expressing XR. D-xylose or L-arabinose transport into the cells led to reversal of the glucose negative phenotype. The addition of a D-xylose or L-arabinose transporter was readily visible as a faster growth on a mixed glucose/pentose medium. This strain is a valuable future tool to screen for efficient D xylose or L-arabinose transporters able for the uptake of these nutrients in the presence of glucose. Finally, the MX4blaster cassette was developed for clean S. cerevisiae genome modifications. This tool allows the complete removal of kanMX4 and other MX4 based markers so that the genome wide gene deletion collection can be used as a tool for multiple gene deletions.Os combustíveis renováveis que não contribuem para aumento do dióxido de carbono atmosférico ganharam maior atenção devido ao peak oil e à possibilidade do dióxido de carbono induzir mudanças climáticas. Em termos de produção anual o bioetanol é atualmente a principal fonte de biocombustíveis, obtido principalmente através da fermentação de hexoses presentes na sacarose, amido de cana ou de milho pela levedura Saccharomyces cerevisiae. O combustível é um produto de baixo valor e o custo de produção é sensível ao rendimento do produto. Uma maneira óbvia para melhorar o rendimento seria também fermentar os açúcares pentoses tais como D-xilose e L-arabinose a partir da fracção de hemicelulose da biomassa. O número de genes alvo para engenharia metabólica com vista à fermentação eficiente das pentoses aumentou para cerca de dez ou mais, tornando a clássica expressão de genes um a um, usando vetores de plasmídeos ou integração genética uma estratégia impraticável. Nesta tese, uma nova ferramenta de montagem de vias que permite a expressão simultânea de pelo menos oito genes foi desenvolvida e denominada The Yeast Pathway Kit (YPK). Esta ferramenta tem várias vantagens em relação aos protocolos de montagem de via alternativa, nomeadamente por permitir a reutilização dos elementos genéticos e montagem racional e aleatória de componentes da via. Usámos o YPK para construir várias estirpes de leveduras expressando o metabolismo inicial de D- xilose (XR e XDH) da levedura utilizadora de D- xilose Scheffersomyces stipitis, juntamente com sobrexpressão de cinase D-xilulose (XKS1) e transaldolase (TAL1), quatro genes no total. Foi ainda construída uma via expressando mais 4 genes adicionais D-ribulose-5 fosfato 3- epimerase (RPE1), ribose-5-fosfato-ceto-isomerase (RKI1) e transcetolase (TKL1) e o gene de Candida intermedia que codifica para o transportador de D-xilose, resultando numa via com 8 genes. Uma via de 4 genes racionalmente concebida permitiu uma taxa de crescimento aeróbico de 0.21 h- 1, que é a mais elevada taxa reportada até à data, possivelmente porque todos os genes participantes estão presentes numa construção multicópia, em contraste com as estirpes descritas anteriormente, onde toda ou uma parte da via foi integrada no genoma numa ou apenas algumas cópias. A sobre-expressão dos quatro genes adicionais na via de oito genes não fez aumentar ainda mais a taxa de crescimento, mas conduziu à fermentação com rendimentos mais elevados de etanol e mais baixos de xilitol. O planeamento manual da montagem de grandes vias metabólicas utilizando o software de edição de DNA é uma tarefa propensa a erros e demorada, sendo também difícil de documentar adequadamente. Assim, desenvolvemos um pacote de software que permite a simulação de operações unitárias de biologia molecular envolvidas na montagem de vias metabólicas que utilizam o YPK. Um protocolo de montagem é expresso numa linguagem de script que permite a simulação da montagem e também serve como uma documentação verificável da experiência. Um passo fundamental no metabolismo de L-arabinose e D-xilose é o seu transporte para dentro da célula. Vários transportadores de L –arabinose e D-xilose de fungos foram identificados e utilizados em estirpes de S. cerevisiae modificadas geneticamente para o catabolismo mais eficiente destes açúcars. Os transportadores encontrados por bioquímica clássica ou através de rastreio funcional com S. cerevisiae recombinante capaz de utilizar pentoses conduziu à identificação de alguns transportadores com cinéticas pobres quando expresso em S. cerevisiae. Assim, desenvolvemos igualmente uma estirpe de triagem funcional inovadora, baseada no fenótipo negativo para glucose do mutante fosfoglucose-isomerase (pgi1) de S. cerevisiae expressando XR. O transporte de D -xilose ou L- arabinose para dentro das células conduziu à reversão do fenótipo negativo desta estirpe na presença de glucose. A expressão de um transportador de D -xilose ou L- arabinose nesta estirpe foi facilmente visível, através de um crescimento mais rápido num meio misto com glucose/pentose. Esta estirpe é uma ferramenta valiosa para futuramente seleccionar transportadores eficientes de D-xilose ou L-arabinose capazes de mediar a entrada destes nutrientes na presença de glucose. Finalmente, a cassete MX4blaster foi desenvolvida para permitir modificações geneticas em S. cerevisiae sem deixar vestígios de DNA heterólogo. Esta ferramenta permite a remoção da cassete kanMX4 e de outros marcadores MX4, permitindo deste modo que a colecção de leveduras possa ser utilizada como uma ferramenta para a deleção múltipla de genesThis work was funded by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal through grant PTDC/AAC-AMB/120940/2010 ‘MycoFat’. Support to CBMA by FEDER through POFC COMPETE and by FCT through grant PEst-C/BIA/UI4050/2011 is also acknowledged