Relevance of tissue macrophages in lung development

Dissertação de Mestrado em Ciências da SaúdeMacrophages are found in almost every tissue, from embryonic to adulthood, with trophic roles during development. In organs such as brain, kidney, mammary gland and pancreas, macrophages reside in considerable number and provide important regulatory functions that shape their development and maturation. Some studies have demonstrated the regulation of developmental morphogenesis by macrophages, more specifically in vascular system formation and branching morphogenesis. Lung is a branching organ and its morphogenesis is dependent on interactions between epithelial and endothelial compartments. Indeed, in fetal lung, macrophages represent around 2-5% of the total lung cells. However, their precise contribution to lung development remains unknown. In this way, the main goal of this work was to unfold the functional role of tissue macrophages on lung development. Therefore, we aimed to understand whether and how macrophage ablation impaired fetal and neonatal lung development, using a macrophage-deficient mouse model (Csf1r-/- mice). The first aim was to characterize lung morphology of Csf1r-/- versus wild type and Csf1r+/- mice. We performed lung stereological analysis (calculation of mesenchymal, epithelial and air space volume density (VD)) at pseudoglandular (embryonic day (E) 15.5), fetal saccular (E18.5) and at post-natal saccular (after birth, P0) developmental stages. The lung mesenchymal VD in Csf1r+/- and Csf1r-/- mice was increased when compared with wild type mice in all stages analysed. At E18.5, beyond an increase in lung mesenchymal, a decrease of epithelial and airspace VD was observed in Csf1r-/- mice. Finally, at P0 stage, Csf1r-/- derived lungs showed a decrease in bronchiolar and air space VD as well as an increase in the mesenchymal VD compared with control group. These results suggested a delay in lung morphogenesis associated with macrophage tissue ablation. Keeping in mind that macrophages support angiogenesis during organ development and remodelling, we assessed vessel density on lungs, by immunohistochemical analysis of CD31 endothelial cell marker. At P0, lungs from Csf1r-/- mice presented a significant decrease in vessel density when compared with wild type mice (p value=0.020). This finding demonstrates a deficiency in lung vascular network associated with macrophage ablation. Furthermore, we quantified RNA expression levels of key angiogenic factors (VEGF-A, Flk-1, Ang-1, Ang-2, Hif-1a and Fgf2) in lung from the different mice groups at E15.5, E18.5 and after birth, P0. At E15.5 stage, an up regulation of VEGF-A, Flk- 1, Ang-2 and Fgf2 transcripts was found. At E18.5 a significant reduction of VEGF-A and Ang-2 RNA levels was demonstrated in Csf1r+/- and Csf1r-/- groups when compared with wild type lungs. However, the opposite trend was observed in P0 knockouts lungs, with an increase in VEGF-A, Flk-1, Ang-1 and Ang-2 transcripts expression levels. This could be explained by compensation mechanisms trying to reverse the deficient lung vasculature (less vessels) observed at P0. In conclusion, all these evidences demonstrate that macrophage ablation is critical to lung development, impairing airway epithelial and vascular compartments.Os macrófagos estão presentes em quase todos os tecidos desde a fase embrionária até à fase adulta, associados a funções tróficas durante o desenvolvimento. Em órgãos como cérebro, rim, glândula mamária e pâncreas, os macrófagos estão presentes em largo número, regulando o desenvolvimento da sua forma e maturação. A literatura tem demonstrado que processos da morfogénese do desenvolvimento como a ramificação e a formação do sistema vascular são altamente regulados pelos macrófagos. E o pulmão é também um órgão de ramificação, dependente da inter-ligação entre a componente epitelial e endotelial. Durante o desenvolvimento fetal deste órgão, os macrófagos representam cerca de 2 a 5 % do número total de células, permanecendo por identicar qual a sua relevância. Neste sentido, o objectivo deste trabalho foi perceber se e como a deleção dos macrófagos influência o desenvolvimento fetal e neo-natal do pulmão, usando um modelo de ratinho com a ablação dos macrófagos (Csf1r-/- ratinho). O nosso primeiro alvo de estudo foi caracterizar a morfologia dos pulmões que provêm de animais Csf1r-/- por comparação com os Csf1+/- e a estirpe selvagem. Desse modo, recorremos a análises esterológicas para calcular a densidade de volume (DV) de uma série de parâmetros como mesênquima, epitélio, espaço aéreo, em pontos específicos do desenvolvimento; no estadio pseudoglandular (desenvolvimento embriónico (E) 15.5), fetal sacular (E18.5) e pósnatal sacular (depois do nascimento, P0). A tendência observada sugere que os pulmões dos ratinhos Csf1r-/- e Csf1r+/- apresentam um aumento da densidade de volume de mesênquima quando comparado com o grupo controlo em todos os estadios. Especificamente a E 18.5, para além da densidade de volume de mesênquima estar aumentada, um decréscimo do epitélio e espaço aéreo foi observado para os Csf1r-/- animais. Por último, logo após o nacimento (estadio P0), os animais Csf1r-/- apresentaram uma diminuição da DV do epitélio bronquiolar e do espaço aéreo comparando com a estirpe selvagem. Estes resultados sugerem um atraso na morfogénse pulmonar associado à deleção dos macrófagos tecidulares. Por outro lado, a regulação dos macrófagos no processo angiogénico durante o desenvolvimento e no processo de remodelação dos vasos, suportou o seguinte foco de estudo. Nós analisamos a densidade dos vasos pulmonares, utilizando o marcador endotelial CD31, por imunohistoquímica. A P0, os pulmões dos animais com o genótipo Csf1r-/- apresentaram um decréscimo significativo comparado com o grupo controlo (p=0.020). Estes resultados demonstram uma deficiência na rede vascular associado com a ablação dos macrófagos. Mais, avaliamos os níveis de expressão de RNA de factores angiogénicos chave como VEGF-A, Flk-1, Ang1, Ang2, Hif-1a e Fgf2, nos pulmões dos diferentes grupos de animais, a E15.5, E 18.5 e P0. A E 15.5 um aumento de VEGF-A, Flk-1, Ang-2 e Fgf2 foram encontrados. A E18.5, um decréscimo nos niveis de expressão de VEGF-A e Ang-2 para os animais Csf1r+/- and Csf1r-/- foi demonstrado. Mas quando avaliamos estes factores no estadio P0, um aumento significativo de VEGF-A, Flk-1, Ang-1 e Ang-2 foram encontrados comparando com o grupo controlo. Este resultado pode dever-se há existência de mecanismos compensatórios que tentam reverter a dificiente vasculaura (menor número de vasos) a P0. Em conclusão, estas evidências demonstram que a deleção dos macrófagos é critica para o desenvolvimento do pulmão, resultando no dano do epitélio das vias aéreas e da vasculatura