Endocytic trafficking and ubiquitylation of plasma membrane transporters in yeast

Tese de Doutoramento em Biologia Molecular e Ambiental (especialidade em Biologia Celular e Saúde)Plasma membrane proteins play a crucial role on cellular physiology, including receptor signaling and uptake of nutrients, neurotransmission and removal of toxic compounds. Endocytosis allows the remodelling of the membrane protein repertoire. Highly evolutionarily conserved post-translational modifications (notably ubiquitylation) were proven to be critical for trafficking, endocytosis and membrane protein degradation. The impairment of the regulated trafficking of membrane proteins such as receptors, transporters and channels is closely associated to several human diseases ethology including hypertension, cardiovascular diseases, diabetes, neurodegenerative diseases and cancer. In fungi, the endocytic pathway of nutrient transporters requires arrestin-like adaptors or simply α-arrestins, which contains PY motifs to directly interact with the Nedd4-like Rsp5 E3 enzyme, being then adaptors for the ubiquitylation system. These α-arrestins are also phospho-regulated by signaling pathways, being a bridge between endocytosis and signaling. The lactate transporter Jen1 from Saccharomyces cerevisiae has been used as a eukaryotic nutrient transporter model. In this thesis, a review on the recent literature regarding carboxylic acid plasma membrane transporters, in S. cerevisiae, was performed, approaching many aspects of cellular physiology, such as function, structure, regulation and evolution. Previous works established that the ubiquitylation and endocytosis of Jen1 lactate transporter, in response to glucose, requires Rod1/Art4 α-arrestin, which is regulated by AMPK/Snf1 kinase and Reg1/PP1 phosphatase. In this thesis, a novel mechanism, requiring the α-arrestin Bul1, was discovered to be involved in the ubiquitylation, endocytosis and vacuolar degradation of Jen1, in response to cycloheximide, prolonged growth in lactate (alkalinization) or rapamycin. This process requires, in some cases, the signaling pathway TORC1 complex and some of its effectors (Tco89 subunit, Tor1 protein, Sit4 phosphatase and Npr1 kinase). Importantly, the activity of Jen1 transporter seems to be required for α-arrestin Bul1 activity, according to the signal. The role of the cytosolic N- and C-terminal regions of the Jen1 transporter of S. cerevisiae was also studied in respect to subcellular trafficking, transport activity and turnover, Rational design and functional analysis of specific Jen1 truncations and chimeric transporters were carried out, based on Jen1 and two other transporters of S. cerevisiae, Gap1 and Fur4, or on the purine transporter UapA from Aspergillus nidulans. Our results show that both cytosolic terminals are important for Jen1 function and regulation. The Nterminal region proved critical for subcellular localization and essential for transport activity and glucose- or alkalinization-elicited endocytosis. The direct involvement of the N-terminal tail in Rod1-dependent, glucose-elicited, endocytic turnover was strongly supported by its ability to confer glucose-elicited endocytosis to UapA, a transporter that is normally stably expressed in S. cerevisiae. The C-terminal region of Jen1 was also shown to be essential for transport activity and critical for trafficking and signal-elicited endocytosis. The results presented herein point to the idea that cytosolic terminals of Jen1 interact and, together, determine its endocytic turnover.As proteínas de membrana plasmática têm um papel crucial na fisiologia celular, incluindo na sinalização por recetores, na entrada de nutrientes na célula e ligação a neurotransmissores ou na remoção de compostos tóxicos. A endocitose permite a remodelação do repertório de proteínas membranares. Modificações pós-traducionais altamente conservadas (nomeadamente a ubiquitilação) têm provado ser críticas no tráfego, endocitose e degradação de proteínas membranares. Defeitos no tráfego regulado de proteínas de membrana plasmática, tal como recetores, transportadores e canais estão intimamente associados a várias patologias humanas, como hipertensão, doenças cardiovasculares, diabetes, doenças neurodegenerativas e cancro. Nos fungos, as vias endocíticas dos transportadores de nutrientes requerem a presença de adaptadores do tipo arrestina ou simplesmente α-arrestinas, que contêm motivos PY necessários para interagir com a Rsp5 ubiquitina ligase E3, da família Nedd4, sendo assim adaptadores para o sistema de ubiquitilação. Essas α-arrestinas são também reguladas por fosforilação/desfosforilação, através vias de sinalização, estabelecendo assim uma ponte entre a endocitose e a sinalização. O transportador de lactato Jen1 em Saccharomyces cerevisiae tem sido utilizado como um modelo de estudo para transportadores de nutrientes. Nesta tese, foi realizada uma revisão da literatura sobre transportadores de carboxilatos em S. cerevisiae, abordando muitos aspetos da sua fisiologia celular, incluindo a função, estrutura, regulação e evolução. Trabalhos prévios estabeleceram que a ubiquitilação e endocitose do Jen1 em resposta à presença de glucose requerem a α-arrestina Rod1/Art4, a qual é regulada pela cinase AMPK/Snf1 e a fosfatase PP1/Reg1. Nesta tese, um novo mecanismo envolvendo a α-arrestina Bul1 mostrou estar envolvido na ubiquitilação, endocitose e degradação vacuolar de Jen1, em resposta à cicloheximida, ao crescimento prolongado em lactato (alcalinização) e à rapamicina. Este processo, requer, em alguns casos, a via de sinalização do complexo TORC1 e alguns dos seus efetores (a subunidade Tco89, a proteína Tor1, a fosfatase Sit4 e a cinase Npr1). De notar que a atividade de Jen1 parece ser requerida para a atividade de Bul1, de acordo com o estímulo considerado. O papel das regiões N- e C-terminais citosólicas do transportador Jen1 de S. cerevisiae foi estudado relativamente ao seu tráfego subcelular, atividade de transporte e turnover. Foi realizado um desenho racional e análise funcional de truncados específicos do Jen1 e transportadores quiméricos, baseados no Jen1 e em outros dois transportadores de S. cerevisiae, o Gap1 e o Fur4, ou no transportador de purinas UapA de Aspergillus nidulans. Os nossos resultados mostram que ambos os terminais citosólicos são importantes para a função e regulação do Jen1. A região N-terminal provou ser crítica para a localização subcelular e essencial para a atividade de transporte e endocitose induzida por glucose ou pela alcalinização. O envolvimento direto da região N-terminal no turnover endocítico induzido por glucose, dependente da arrestina Rod1, foi confirmado pela sua capacidade de conferir endocitose induzida por glucose ao UapA, um transportador muito estável quando expresso em S. cerevisiae. A região C-terminal do Jen1 também se revelou essencial para a atividade de transporte e critica para o tráfego e endocitose induzida por sinais específicos. Os resultados apresentados apontam para a ideia de que os terminais citosólicos de Jen1 interagem e, em conjunto, determinam o seu turnover endocítico.This work was financial supported by Portuguese Government through Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) and European Commission Erasmus+ programme. In particular, I was granted with 4 years PhD fellowship from FCT (SFRH/BD/86221/2012