Nanogéis de glicol quitosano

Tese de doutoramento em Engenharia BiomédicaNanoparticles based on chitosan have been extensively studied for gene, drug and contrast agent delivery. The present work aimed to develop and characterize a glycol chitosan nanogel - also designated macromolecular micelles or hydrogel nanoparticles. The nanogel is obtained by chemically grafting hydrophobic chains on the hydrophilic glycol chitosan backbone, the amphiphilic structure obtained being capable of self-assembly in water, originating quite reproducible nanostructures with few hundred nanometers. The nanogel was decorated with folate conjugated polyethylene glycol, for active targeting purposes, as subsequently confirmed by in vitro assays. The positively charged nanogels exhibited colloidal stability up to at least four months. Considering their ability to complex siRNA, nanogels could represent promising vehicles for siRNA delivery. Moreover, their hydrophobic moieties could also carry hydrophobic drugs/imaging agents beyond nucleic acids, according to the theragnosis concept. The safety of the glycol chitosan nanogel as drug delivery system was comprehensively studied, since the biocompatibility of nanogels is still insufficiently reported. No cytotoxicity was detected in cell lines, RAW, 3T3, HMEC and HeLa, although a slight decrease on metabolic activity had been observed. Glycol chitosan nanogel didn’t induce cell membrane damage, cell death by apoptosis and/or necrosis, and cell cycling arresting (with exception to G1 arresting in RAW cells). Remarkably, glycol chitosan nanogel was poorly internalized by mouse bone marrow derived macrophages and does not trigger the activation of the complement system. Its blood compatibility was also confirmed through haemolysis and whole blood clotting time assays. The interaction of the nanogel with biological tissues, namely the endocytic mechanisms used by folate functionalized nanogels to entry HeLa cells, and the subsequent intracellular fate were studied using siRNA technology to deplete key proteins on regulation of each tested pathway. The nanogel cellular uptake is folate dependent, as expected since HeLa cells overexpress folate receptors. The internalization occurred mainly through clathrin and caveolin independent mechanisms, specifically by flotillin-1 and Cdc42-dependent endocytosis, as well as through micropinocytosis. Once internalized, after 7 h of incubation, approximately half of the nanogel was visualized in endolysosomal compartments, while the remaining was present in undefined regions of the cytoplasm. The biodistribution profile of the folate decorated glycol chitosan nanogel was assessed using in vivo near infrared fluorescence imaging as tool to track the nanogel over time in a mice model, after intravenous injection. Rapid nanogel whole body distribution was observed at early time points, and it is still detectable in a very wide distribution at least 6 h post-administration. The blood clearance occurred about 6 h post injection, with a blood half-life of approximately 2 h; surprisingly, the linear glycol chitosan seems to undergo a slower blood clearance. No accumulation in the organs was verified, the clearance from the body being observed apparently after a period of about 48h. In conclusion, the physicochemical features, the ability to complex nucleic acids and certain hydrophobic drugs, cell targeting ability, biocompatibility, internalization and intracellular trafficking, the fairly long blood circulation half-life and suitable body clearance, are pronounced hints of the engineered GC nanogel as a promising drug delivery system.Nanopartículas à base de quitosano têm sido largamente estudadas para transportar ácidos nucléicos, fármacos e agentes de contraste. O presente trabalho tem por objectivo desenvolver e caracterizar um nanogel de glicol quitosano - também designado por micelas macromoleculares ou hidrogéis nanoparticulados. O nanogel é obtido através do enxerto químico de cadeias hidrofóbicas na estrutura hidrofílica do glicol quitosano, resultando uma estrutura anfifílica capaz de auto-organizar-se em água, originado nano-estruturas bastantes reprodutivéis com poucas centenas de nanómetros. O nanogel foi decorado com ácido fólico conjugado com polietilenoglicol para efeito de direccionamento controlado, tal como posteriormente confirmado em ensaios in vitro. O nanogel de natureza catiónica exibiu estabilidade coloidal pelo menos durante 4 meses. Considerando a sua habilidade para complexar siRNA, os nanogéis podem representar veículos promissores para transporte/entrega de siRNA. Além disso, os domínios hidrofóbicos podem também transportar fármacos hidrofóbicos/agentes de imagem para além de ácidos nucléicos, de acordo com o defendido no conceito de teragnóstico. A fiabilidade do nanogel de glicol quitosano como sistema de entrega de drogas foi estudada exaustivamente, uma vez que a biocompatibilidade dos nanogéis está ainda pouco reportada. Ausência de citotoxicidade foi observada nas linhas celulares RAW, 3T3, HMEC e HeLa, embora se tenha verificado uma ligeira diminuição na actividade metabólica das mesmas. O nanogel de glicol quitosano não danifica a membrana celular, assim como não induz morte celular por apoptose e/ou necrose, nem paragens no ciclo celular (com excepção para as células RAW onde se verifica paragem na fase G1). Surpreendentemente, o nanogel de glicol quitosano foi fracamente internalizado por macrófagos derivados de medula óssea de ratinho, para além de não desencadear a activação do sistema complemento. A sua hemocompatibilidade foi também confirmada através de ensaios de hemólise e de coagulação. A interacção do nanogel com os tecidos biológicos, nomeadamente os mecanismos de endocitose utilizados pelos nanogéis funcionalizados com ácido fólico para entrarem nas células HeLa e subsequente percurso intracelular foram estudados recorrendo à tecnologia de siRNA para silenciar proteínas chave na regulação de cada via analisada. A internalização do nanogel mostrou ser dependente do ácido fólico, tal como esperado uma vez que as células HeLa sobre-expressam receptores para ácido fólico. A internalização ocorreu principalmente através de mecanismos independentes de clatrina e caveolina, mais especificamente encocitose dependente de flotilina-1 e Cdc42, bem como macropinocitose. Uma vez internalizado, depois de 7 h de incubação, cerca de metade da população do nanogel foi visualizada em compartimentos endolisossomais enquanto que a porção restante se encontra em regiões indefinidas do citoplasma. O perfil de biodistribuição do nanogel de glicol quitosano decorado com ácido fólico foi avaliado num sistema de imagiologia in vivo de fluorescência no infravermelho próximo como ferramenta para monitorizar a distribuição do nanogel após injecção intravenosa ao longo do tempo, num modelo de ratinho. Uma rápida distribuição do nanogel por todo o corpo foi observada logo nos tempos mais precoces, sendo ainda detectável uma ampla distribuição até pelo menos 6 h após a administração. O desaparecimento do nanogel do sangue ocorreu cerca de 6 h após injecção, com um tempo de meia-vida de aproximandamente 2 h; surpreendentemente, o glicol quitosano de estrutura linear mostrou desaparecer mais lentamente do sangue. Não se verificou acumulação nos órgãos, e o desaparecimento do corpo acontece num período de aproximadamente 48h. Em conclusão, as características físico-químicas, a capacidade de complexar ácidos nucléicos e certamente fármacos hidrofóbicos, direcionamento celular, biocompatibilidade, internalização e percurso intracelular, período de semi-vida no sangue relativamente longo e razoável período de eliminação do corpo, são indícios de que o nanogel produzido poderá ser um sistema promissor de libertação controlada de drogas.The grant SFRH/BD/64977/2009, SFRH/BD/27359/2006, SFRH/BD/27404 / 2006, from Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal. This review was also supported by FCT through the project PTDC/BIO/67160/2006