The transcriptome of the Oncogenic HOXA9 homeoprotein in human glioblastoma : functional and clinical relevance

Dissertação de mestrado em Genética MolecularGliomas are a heterogeneous group of neoplasias that account for the majority of primary tumors of the central nervous system, of which glioblastoma (GBM) is the most common and malignant subtype. These are dramatic diseases for which no curative therapies are yet available. The clinical responses of GBM patients are particularly poor and vary greatly among individuals, especially due to the heterogeneity of their molecular alterations. Regardless, these patients are equally treated with a standardized therapeutic approach, mainly due to the lack of wellestablished molecular prognostic markers. Recently, the reactivation of HOXA9 expression in GBM has been implicated as a poor prognostic marker. As HOXA9 is a transcription factor, we hypothesized that a set of HOXA9-transcriptionally regulated genes may be its true biological effectors. In this sense, we aimed to characterize the HOXA9 transcriptome in GBM to identify novel prognostic biomarkers and putative therapeutic targets. By analyzing expression microarrays in HOXA9-negative and positive U87MG and hTERT/E6/E7 cells, we found a vast number of genes regulated by HOXA9 that are involved in important hallmarks of cancer as proliferation, invasion, and therapy resistance. Interestingly, we found high expression of the long non-coding RNA HOTAIR (HOX transcript antisense intergenic RNA) in HOXA9-positive GBM cell lines, consistent with a significant co-expression between HOTAIR and HOXA9 in highgrade gliomas, particularly GBMs. Mechanistically, using chromatin immunoprecipitation and quantitative PCR analysis in GBM cell lines, we found that HOXA9 directly interacts with the promoter region of HOTAIR and induces its transcription. Importantly, GBM patients with high expression of HOTAIR had a relatively shorter overall survival, independently of other putative prognostic factors. Using in silico analysis we found other putative direct targets of HOXA9, and ChIP analysis proved the direct regulation of WNT6 (Wingless-Type MMTV Integration Site Family Member 6) by HOXA9. Our study provides the first characterization of HOXA9 target genes in the context of GBM, and identifies new clinically-relevant prognostic biomarkers, which may be new therapeutic targets to treat this aggressive malignancy.Os gliomas são um grupo heterogéneo de neoplasias que constituem a maioria dos tumores primários do sistema nervoso central, dos quais o glioblastoma (GBM) é o simultaneamente o mais comum e o mais maligno. Actualmente não existem ainda terapias eficazes para estas neoplasias altamente agressivas. A resposta clínica dos pacientes de GBM é extremamente insatisfatória e variável entre indivíduos, sobretudo devido à heterogeneidade das alterações moleculares presente nestes tumores. Devido à falta de factores de prognóstico bem estabelecidos, todos os pacientes são tratados com a mesma abordagem terapêutica. Recentemente, a reactivação da expressão do HOXA9 em GBM foi implicada como um marcador de pior prognóstico. Como o HOXA9 é um factor de transcrição, colocamos a hipótese de que um grupo de genes regulados pelo HOXA9 poderão ser os seus efetores biológicos. Assim, tivemos como objectivo caracterizar o transcriptoma do HOXA9 em GBM, para identificar novos biomarcadores de prognóstico e potenciais alvos terapêuticos. Pela análise de microarrays de expressão em linhas celulares U87MG e hTERT/E6/E7, com e sem a expressão de HOXA9, verificámos que muitos dos genes-alvo do HOXA9 regulam características críticas no cancro, como a proliferação, a invasão e a resistência à terapia. Verificámos ainda uma expressão aumentada do RNA não-codificante HOTAIR (HOX transcript antisense intergenic RNA) em células de GBM HOXA9-positivas, um resultado consistente com a co-expressão entre HOTAIR e HOXA9 em gliomas primários de alto-grau. Usando imunoprecipitação da cromatina (ChIP) e PCR quantitativo em linhas celulares de GBM verificámos que o HOXA9 interage directamente com a região promotora do HOTAIR, induzindo a sua expressão. Encontrámos também uma relevante associação entre altos níveis de expressão do HOTAIR e uma pior sobrevida dos pacientes de GBM. Por análises in silico, encontrámos outros potenciais alvos directos do HOXA9, tendo validado o WNT6 (Wingless-Type MMTV Integration Site Family Member 6) por ChIP. Resumindo, o nosso estudo providencia a primeira caracterização dos alvos do HOXA9 em GBM, e identifica novos biomarcadores de prognóstico, que poderão auxiliar a racionalização das decisões terapêuticas, bem como vir a ser testados como novos alvos terapêuticos