Produção de β-galactosidase por levedura recombinante : desenvolvimento de um sistema de produção estável

A tecnologia do DNA recombinante é uma ferramenta muito utilizada na produção de roteínas em sistemas heterólogos, proteínas essas de elevado valor acrescentado que são, por natureza, produzidas em baixas quantidades. Com este trabalho pretendeu-se construir estirpes floculantes de Saccharomyces cerevisiae que apresentassem uma produção estável de β-galactosidase de Aspergillus niger por integração do gene que codifica para a expressão desta enzima (lacA) nas sequências δ do genoma desta levedura. Foram utilizados dois sistemas de integração distintos. Um deles utiliza como marca de selecção dominante a resistência ao antibiótico G418 e permite a integração de cópias tandem enquanto que o outro sistema utiliza a marca URA3 e a integração é efectuada em diferentes sítios, com uma única cópia em cada sítio. O gene lacA, ladeado pelo promotor e terminador ADH1, foi clonado em ambos os sistemas que foram seguidamente utilizados para transformar as estirpes S. cerevisiae NCYC869-wt (MatαFlo1) e S. cerevisiae NCYC869-A3 (MatαFlo1ura3), respectivamente. Para o primeiro sistema foram testadas concentrações de antibiótico de 0,2 a 1,5 g/l enquanto que para o segundo sistema foram efectuadas 3 rondas de transformação usando sempre a mesma marca de selecção uma vez que o gene URA3 vai sendo eliminado por recombinação das sequências repetidas que o flanqueiam (hisG). Os transformantes foram seleccionados para estudos posteriores pela actividade de β-galactosidase devido à presença de X-gal nas placas selectivas, ou seja, foram seleccionados pela intensidade de cor azul. Ambos os sistemas de transformação permitiram obter transformantes de S. cerevisiae utilizadores de lactose. Independentemente da marca de selecção utilizada, foram observados diferentes níveis de floculação e diferentes níveis de produção de β-galactosidase. Globalmente, os níveis de produção de β-galactosidase foram mais elevados para o primeiro sistema. Os transformantes que susceptibilizaram maior interesse foram caracterizados geneticamente por hibridação Southern. Para o primeiro sistema, foram observados, no máximo, dois sítios de integração usados em simultâneo com cópias tandem e 8 cópias integradas no total, enquanto que para o segundo, após as 3 rondas de transformação e perda do gene URA3, observou-se apenas dois sítios de integração usados em simultâneo correspondentes a 2 cópias integradas. O melhor transformante seleccionado, pertencente ao primeiro sistema (1,5 g/l de G418), apresenta actividade de β-galactosidase em glucose comparável ao sistema de referência, baseado em plasmídeo epissomal (S. cerevisiae NCYC869-A3/pVK1.1), e apresenta estabilidade das inserções após 8 culturas sequenciais com pelo menos 10 gerações cada. Apesar de crescer em lactose como única fonte de carbono e energia, a produção de β-galactosidase, o nível de floculação e a rapidez no consumo de lactose são inferiores à estirpe de referência.Recombinant DNA technology is a widely used tool in the production of proteins in heterologous systems, namely for high value proteins that are, naturally, produced in low quantities. This work aims to construct flocculent Saccharomyces cerevisiae strains with Aspergillus niger β-galactosidase stable production by using the repeated chromosomal δ sequences of the yeast as target sites for the lacA gene (coding for A. niger β-galactosidase) integration. Two different integration systems were used. One uses as dominant selection marker the G418 antibiotic resistance and allows for tandem integrations, while the other uses the URA3 selection marker and integration occurs at different sites with one single copy of the gene at each site. The lacA gene, flanked by ADH1 promotor and terminator, was cloned in both systems that were used in the transformation of S. cerevisiae NCYC869-wt (MatαFlo1) and S. cerevisiae NCYC869-A3 (MatαFlo1ura3) strains, respectively. In the first system different G418 concentrations were used raging from 0.2 to 1.5 g/l while in the other system 3 rounds of transformation using the same selection marker were made, once the URA3 gene is “pooped” out by recombination between flanking direct hisG repeats. In addition, transformants were selected for further studies based on the blue tonality of the colony. Due to the presence of X-gal in selective medium plates, a deeper blue colour of the colony indicated increased β-galactosidase activity. Both integration systems resulted in recombinant S. cerevisiae strains that grow on lactose. Independently of the selection marker used, different flocculation and β-galactosidase expression levels were observed. Overall, transformants obtained from the first system presented higher β-galactosidase extracellular production. The most interesting transformants were characterized genetically by Southern analyses. For the first system, one or two integration sites were observed, with tandem copies and 8 gene copies integrated in maximum, while for the second system, after 3 rounds of transformation and URA3 gene loss, 2 different sites were used for integration, corresponding to 2 gene copies. The best transformant obtained, belonging to the first system (selected with G418 1.5 g/l), has β-galactosidase activity in glucose comparable to the reference epissomal based plasmid strain (S. cerevisiae NCYC869-A3/pVK1.1) and reveals great integration stability after 8 sequential batch cultures with, at least, 10 generations each. Despite of growing on lactose as the only carbon and energy source, β-galactosidase expression level, flocculation level and lactose consumption time were lower than those obtained with the reference strain