Characterization of cisplatin-induced cell death in Saccharomyces cerevisia

Dissertação de mestrado em Genética MolecularCisplatin is a highly effective chemotherapeutic drug used in the treatment of several cancers, such as testicular, ovarian, cervical, head and neck and small-cell lung cancer. It is a DNA-damaging agent that induces apoptosis of rapidly proliferating cells, an important factor underlying its therapeutic efficacy. Unfortunately, despite high cure rates, its curative potential is often impaired when cells develop drug resistance. Multiple factors may contribute to the development of drug resistance, i.e., enhanced efflux, oncogene overexpression and defects in apoptosis pathways, and this problem has yet to be overcome. Most of the studies in this field have been conducted in cultured mammalian cells, which are not amenable to systematic genetic manipulation. In fact, much of our current knowledge of mechanisms of fundamental relevance in cancer, such as the DNA damage and checkpoint pathways, is based on yeast genetics. This tool has not been used to extensively study DNA damage-induced apoptosis mainly because for a long time it was thought that yeast cells did not possess an apoptotic program. It is now widely accepted that yeast exhibit an apoptotic-like death (ALD) in response to several unfavourable conditions, including certain types of DNA damage. This finding provided an opportunity to apply the power of yeast genetics to investigate apoptotic responses to chemotherapeutic drugs. The aim of this work was to establish a simplified model to study cisplatin-induced apoptosis using the yeast Saccharomyces cerevisiae. Our results indicate that cisplatin induces an active form of cell death in yeast, as this process was partially dependent on new protein synthesis and did not lead to loss of membrane integrity. Preliminary studies of apoptotic markers revealed mitochondrial fragmentation and chromatin condensation after cisplatin exposure. Deletion of Yca1p, the yeast metacaspase, did not protect cells from cisplatin-induced cell death, although exposure of yeast cells to cisplatin resulted in an increase in proteolytic activity. In vivo, co-incubation with MG132, a commonly used proteasome inhibitor, increased resistance to cisplatin and, accordingly, yeast strains deficient in proteasome proteolytic activity, and to some extent, the regulatory activity, were more resistant to cisplatin than wild type strains. Our results indicate that the ubiquitin-proteasome pathway, and particularly the proteasome, is involved in cisplatin-induced cell death in budding yeast. This work provides novel insights regarding cisplatin-induced cell death and indicates that although this mechanism does not display all the features of an apoptotic process, it can be characterized as programmed cell death.A cisplatina é um agente quimioterapêutico muito eficaz no tratamento de vários tumores. É um agente causador de danos de DNA, induzindo a morte por apoptose em células com grande capacidade proliferativa. No entanto, apesar das altas taxas de sucesso, a capacidade terapêutica da cisplatina é inibida quando as células desenvolvem mecanismos de resistência. Vários fatores contribuem para o desenvolvimento de resistência, como por exemplo o aumento dadetoxificação celular, aumento da expressão de oncogenes ou erros na via de apoptose, fatores estes que são difíceis de transpor. A maioria de estudos nesta área foram realizados em linhas de células animais, mas, como são sistemas com grande variabilidade genética e de díficil manipulação, torna-se problemático o estudo de certos mecanismos celulares nestes modelos. Para ultrapassar este problema, o recurso a modelos celulares mais simples, como as leveduras, é bastante vantajoso. Com a descoberta de que as leveduras podem cometer morte celular semelhante a apoptose em resposta a estímulos ou condições ambientais desfavoráveis, estas tornaram-se um modelo muito útil que permite o estudo do fenómeno de apoptose em resposta a compostos quimioterapêuticos. Deste modo, o objectivo deste trabalho foi estabelecer um modelo simplificado para o estudo da via apoptótica induzida pela cisplatina, usando a levedura Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos indicam que a morte celular causada por cisplatina é um processo activo em leveduras, pois é dependente da síntese de novo de proteinas e não provoca perda da integridade membranar, uma característica de morte acidental por necrose. Estudos preliminares para a detecção de marcadores de apoptose revelam também que, a exposição celular à cisplatina causa fragmentação mitocondrial e condensação da cromatina. Interrupção do gene YCA1, que codifica a metacaspase Yca1p, não mostrou um efeito protetor em relação à cisplatina, apesar de esta ter induzido um aumento da actividade proteolítica. Este fato levou ao estudo do envolvimento de proteases neste processo, como o proteosoma. In vivo, a inibição do proteosoma pelo composto MG132 revelou um aumento da resistência celular em relação à cisplatina. De acordo com este resultado, testes com estirpes mutantes em proteinas relacionadas com a actividade do proteosoma comprovaram que a inibição da função do proteosoma leva a um aumento da resistência celular à cisplatina. Este estudo revelou que a morte celular induzida pela cisplatina é dependente da actividade do proteasoma e que, apesar de não evidenciar todas as características comuns à apoptose, é um processo de morte celular programada