Desenvolvimento e caracterização de modelos transgénicos em ratinho para a doença de Machado-Joseph

Tese de Doutoramento em Ciências da SaúdeSince the early 90’s a new class of inherited neurodegenerative diseases has been characterized, the polyglutamine (polyQ) expansion diseases. As the name indicates, the mutation underlying each of these disorders is an expansion of a CAG trinucleotide repeat that encodes a polyQ tract in the respective disease proteins. Although polyQ diseases present different clinical features and neuronal degeneration pattern, increasing evidences pointed out to important common features in the pathogenesis, in particular the abnormal protein conformation(s) promoted by polyQ expansion with the consequent accumulation in neuronal inclusions (NIs). Although the polyQ diseases are rare disorders individually, this group is composed by nine progressive and finally fatal disorders, which in general begin in adulthood and progress over 10 to 30 years, normally implicating the full time dedication to patient care by a member of the family. The economic and social impact of these neurodegenerative diseases has led several researchers worldwide to investigate the pathogenesis mechanism and therapeutic strategies for polyQ diseases. Animal models have proved to be an essential tool in this field due to their importance in the development of therapeutic trials but also for the performance of longitudinal studies of disease progression. In the present study, we generated several novel transgenic mouse models of a polyQ disease, Machado-Joseph disease (MJD), in order to study its pathogenic mechanism and perform therapeutic trials. We have obtained three MJD transgenic lines carrying the cDNA variant MJD1-1 with three different expanded CAG repeats tracts; 83, 94 and 135 CAGs, respectively. The transgenic mice with the lower CAG repeat tract (CMVMJD83) did not manifest the disease even at advanced ages, while the CMVMJD94 transgenic mice developed a mild motor phenotype even in hemizygous animals (in accordance with the autosomal dominant feature of MJD) and brain pathology in the CNS in the absence of NIs. Interestingly, the motor phenotype manifestation in CMVMJD94 mice was correlated with the length of the CAG repeat tract. With the increase of the polyQ tract to 135 glutamines in the human ataxin-3 protein (ATXN3) expressed by transgenic animals (CMVMJD135), we have successfully established a mouse model displaying several of the neurological symptoms of MJD that appear gradually in time, allowing the study of the disease progression. In addition, to further validate the therapeutic value of autophagy activation in MJD we have performed a pilot therapeutic trial, using lithium and the combination of lithium and temsirolimus; however, we could not find an amelioration of the MJD symptoms in our model CMVMJD135 at the doses of drugs used in this work.Desde o início dos anos noventa foi caracterizada uma nova classe de doenças neurodegenerativas hereditárias, as doenças de expansão de poliglutaminas (poliQ). Como o próprio nome indica, a mutação causadora da doença é a expansão de uma repetição de um trinucleótido de CAG que codifica um segmento de poliQ na proteína causadora da doença. Embora as doenças de poliQ apresentem diferenças clínicas e no padrão de neurodegenerescência, várias evidências apontam para a existência de características comuns na patogénese destas doenças, em particular a conformação anormal da proteína causada pela expansão de poliQ, que leva à sua acumulação em inclusões neuronais. Apesar das doenças de poliQ serem doenças raras no contexto individual, este grupo é constituído por nove doenças progressivas e fatais, com início na idade adulta e progredindo durante 10 a 30 anos, o que leva na maioria dos casos à necessidade de um membro da família prestar cuidados ao doente a tempo inteiro. O impacto sócio-económico destas doenças neurodegenerativas tem levado vários grupos de investigação pelo mundo inteiro a investigar o mecanismo patogénico assim como estratégias terapêuticas para as doenças de poliQ. Os modelos animais para as doenças de poliQ são uma ferramenta essencial no estudo destas doenças devido à sua enorme importância para o desenvolvimento de ensaios terapêuticos mas também para a realização de estudos longitudinais durante a progressão da doença. No presente estudo, foram gerados modelos transgénicos para uma doença de poliQ, a doença de Machado-Joseph (DMJ) de modo a serem estabelecidos como modelos da doença, para o estudo do seu mecanismo patogénico e para a realização de ensaios terapêuticos. Foi possível estabelecer três modelos da DMJ em ratinho contendo a variante MJD1-1 de cDNA com três diferentes segmentos expandidos de CAGs, com 83, 94 e 135 unidades, respectivamente. A linha transgénica com o menor tamanho de CAG (CMVMJD83) não manifestou a doença mesmo em idades avançadas, enquanto os ratinhos transgénicos CMVMJD94 apresentaram um fenótipo motor ligeiro, presente tanto nos ratinhos hemizigóticos como nos homozigóticos (em concordância com a transmissão autossómica dominante da doença), assim como patologia no sistema nervoso central, apesar da ausência de inclusões neuronais. De salientar que a manifestação do fenótipo motor na linha CMVMJD94 apresentava uma correlação com o tamanho do segmento de CAGs. Com o aumento do tracto de poliQ para 135 glutaminas na ataxina-3 humana (ATXN3) expressa nos ratinhos transgénicos (CMVMJD135) foi possível obter e estabelecer um modelo animal para a doença com mais sintomas neurológicos da DMJ que surgem de uma forma gradual ao longo da vida do animal, modelando a progressão da doença. De modo a validar a possível importância terapêutica da activação da autofagia na DMJ efectuámos um ensaio terapêutico piloto utilizando lítio e a combinação de lítio e temsirolimus; contudo, não observámos um melhoramento dos sintomas da DMJ no nosso modelo CMVMJD135 com as dosagens utilizadas neste trabalho.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Bolsa de Doutoramento (SFRH/BD/15910/2005), projecto POCI/SAU-MMO/60412/2004, PTDC/SAU-GMG/64076/2006Ataxia MJD, US