Desenvolvimento da técnica de DNA metabarcoding para identificação e inventário de espécies em comunidades macrobentónicas marinhas

Dissertação de mestrado em Molecular GeneticsIn marine and estuarine benthic communities, the inventory and estimation of species richness are often hampered by the need of broad taxonomic expertise across several phyla. The use of DNA metabarcoding has emerged as a powerful tool on the fast assessment of species composition from whole environmental communities. Yet, specifically designed methodologies for marine and estuarine macrobenthic communities are still lacking. Here we tested the amplification success of five primer sets targeting different COI-5P regions with fragments ranging from 310 to 658 bp. To this end, we used two simulated macrobenthic communities (SimCom1 and 2), each community containing the same number of species (21), but different number of specimens (SimCom1: 21; SimCom2: 67). Sequences were generated using high-throughput sequencing on 454 platform and species identification were first performed against a compiled reference library of macrobenthic species. In order to achieve new identifications at species level, which had no representation in the reference library, two public databases, BLASTn and BOLD-IDS, were used to rerun those sequences with similarity between 70-97%. Interestingly, amplicons of 313 and 658 bp were equally successful on the detection of species in SimCom1 (≈62%), while for SimCom2 the highest success rate were obtained using a 418 bp fragment. However, the combination of the five primer sets was able to detect more sequences than any primer set alone, achieving 85% of represented species in SimCom1 and 76% in SimCom2, across all analysed marine phyla (Annelida, Arthropoda and Mollusca). Unrepresented species were also detected in these communities, such as algae and the mussel parasitic copepod Mytilicola intestinalis. We demonstrated that the application of combined primer sets coupled with high-throughput technologies has a great potential to overcome the challenges on marine bioassessment, and inventory, including the detection of a “hidden” biodiversity that could not possibly be identified based on morphology.O inventário e a estimativa da riqueza de espécies, em comunidades bentónicas marinhas e estuarinas, são frequentemente dificultados pela necessidade de um amplo e especializado conhecimento taxonómico dos diversos filos. A utilização de DNA metabarcoding surgiu como uma ferramenta poderosa para uma rápida avaliação da composição das espécies constituintes das comunidades ambientais. No entanto, ainda falta conceber metodologias especificamente desenhadas para comunidades macrobentónicas marinhas e estuarinas. No presente estudo, testou-se o sucesso de amplificação de cinco pares de primers referentes a diferentes regiões do gene COI-5P com fragmentos que variam entre 310 a 658 pb. Com esta finalidade, usou-se duas comunidades macrobentónicas simuladas (SimCom1 e 2), cada comunidade contendo o mesmo número de espécies (21), mas um diferente número de espécimes (SimCom1: 21; SimCom2: 67). Usou-se a sequenciação de alto débito na plataforma 454 para gerar sequências e a identificação de espécies foi primeiramente realizada contra uma biblioteca de referência compilada de espécies macrobentónicas. De modo a obter-se novas identificações ao nível da espécie, que não tinham representação na biblioteca de referência, foram usadas duas bases de dados públicas, BLASTn e BOLD-IDS, para executar novamente as sequências com similaridades entre 70-97%. Curiosamente, os amplicões de 313 e 658 pb foram igualmente bem-sucedidos na deteção de espécies na SimCom1 (≈62%), enquanto que para SimCom2 obteve-se a maior taxa de sucesso utilizando o fragmento de 418 pb. No entanto, a combinação dos cinco pares de primers foi capaz de detetar mais sequências do que qualquer par de primers por si só, obtendose 85% das espécies representadas em SimCom1 e 76% em SimCom2, em todos os filos marinhos analisados (Annelida, Arthropoda e Mollusca). Nas comunidades simuladas também foram detetadas espécies que não estavam representadas, como algas e o copépode parasita de mexilhões Mytilicola intestinalis. Este estudo demonstrou que através da aplicação de combinações de pares primers juntamente com tecnologias de alto débito há um grande potencial para ultrapassar os desafios da avaliação e do inventário da biodiversidade marinha, incluindo a deteção de biodiversidade “escondida”, a qual não seria possível identificar através da morfologia.Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) - Project FCOMP-01-0124-FEDER-015429;The present study was financed by FEDER through POFC-COMPETE;Work at CBMA was supported by FCT I.P. through the strategic funding UID/BIA/04050/2013