Development and validation of a PNA-FISH method for Vibrio detection

Master’s Degree in BioengineeringAs doenças relacionadas com o consumo de alimentos contaminados constituem um sério problema global de saúde pública e são responsáveis por um grande número de infeções, hospitalizações e até mesmo mortes. A estratégia mais eficaz para controlar e prevenir este tipo de doenças passa por uma identificação precoce de alimentos contaminados a fim de se evitar a entrada destes produtos na cadeia de consumo. Sabe-se que entre os principais patogénios alimentares estão Escherichia coli O157, Salmonella spp. e Listeria monocytogenes. No entanto, em zonas costeiras, onde o consumo de marisco e peixes é mais frequente, o surgimento de Vibrio spp., género de bactérias aquáticas gram-negativas, como principais causadoras de doenças associadas ao consumo destes alimentos tem vindo a aumentar. De entre as espécies de Vibrio; Vibrio vulnificus, Vibrio choleare e Vibrio parahaemolyticus destacam-se como sendo as mais importantes no que diz respeito à segurança alimentar. Técnicas como a de hibridação fluorescente in situ (FISH) com recurso a sondas de ácido péptido nucleico (PNA), têm vindo a afirmar-se nos últimos anos com diversas aplicações para a deteção de patogénios alimentares. PNA-FISH é uma técnica de deteção simples, rápida e altamente sensível que envolve a hibridação de sondas marcadas com fluorescência, que têm como alvo regiões conservadas do RNA ribossomal bacteriano. A estrutura da molécula de PNA permite que as sondas se liguem rapidamente aos alvos de DNA ou RNA com melhor estabilidade térmica e uma maior afinidade do que outras moléculas. O objetivo deste trabalho passou pela otimização das sondas de PNA de maneira a uniformizar as condições de hibridação para uma abordagem multiplex para deteção de V. vulnificus, V. cholerae e V. parahaemolyticus em alimentos. Posteriormente, o meio Alkaline Saline Peptone Water (ASPW) foi avaliado como forma de enriquecimento para o crescimento simultâneo de V. vulnificus, V. cholerae e V. parahaemolyticus a partir de amostras alimentares, com o objectivo de encontrar um passo de enriquecimento adequado para a técnica de PNA-FISH. Após os ensaios de otimização das sondas de PNA chegou-se à conclusão que as condições ótimas de hibridação para as três bactérias eram semelhantes, por isso, uma verdadeira abordagem multiplex seria possível. Contudo a avaliação do meio de enriquecimento, ASPW, não foi conclusiva. A maior parte dos alimentos apresentava contaminação natural com V. parahaemolyticus; enquanto as espécies de V. cholerae e V. vulnificus demonstraram ser de difícil crescimento na presença da microflora natural da matriz alimentar.Foodborne diseases and consequently foodborne pathogens are an important cause of human illness worldwide, causing a considerable number of infections, hospitalizations and even deaths. These diseases are associated with the consumption of contaminated food products and, thus, the infection sources and routes of transmission are very diverse. Many efforts have been made in the last decades to prevent and control foodborne diseases; but the most efficient strategy relies in the earlier identification of food contamination in order to prevent the release of contaminated products. It is known that the main foodborne pathogens are: Escherichia coli O157, Salmonella spp. and Listeria monocytogenes. However, in coastal areas, where the consumption of fish and seafood is more frequent, the appearance of Vibrio spp., aquatic gram-negative bacteria, has been increasing as the main cause of diseases associated with the consumption of raw seafood. Among the Vibrio species, Vibrio vulnificus, Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus stand out as being the most threatening with regard to food safety. Some techniques, such as peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA-FISH), have been emerging in the last years with several applications for the detection of foodborne pathogens. PNA-FISH is a simple, rapid, and highly sensitive technique, which involves the use of probes coupled with fluorescence labels, which target conserved regions of the bacteria ribosomal RNA. The structure of the PNA molecule allows the probes to bind quickly to the target DNA or RNA with better stability and affinity than other molecules. The aim of this work was the probes optimization, to standardize the hybridization conditions for a multiplex approach for the detection of V. vulnificus, V. cholerae and V. parahaemolyticus in food samples. Later, Alkaline Saline Peptone Water (ASPW) was evaluated as an enrichment medium for the simultaneous enrichment procedure of V. vulnificus, V. cholerae and V. parahaemolyticus. After the experiments, similar optimum conditions of hybridization were obtained for the three bacteria; therefore, a multiplex approach would be possible. However, the evaluation of the enrichment step with ASPW, was not conclusive. Most of the food samples presented natural contamination with V. parahaemolyticus; while V. cholerae, and V. vulnificus demonstrated to be the difficult to growth due to the natural microflora of the food matrix