Development of electrospun nanofibrous-based scaffolds for bone regeneration

Tese de doutoramento em Ciência e Tecnologia de Materiais (área do conhecimento em Engenharia de Tecidos, Medicina Regenerativa e Células Estaminais)Biomaterials and scaffolds play a significant role in many strategies followed in regenerative medicine and tissue engineering. Those systems are intended and designed to help and guide the cells to contribute for the tissue regeneration process. To achieve that goal, the system needs to actively participate in the signaling process for the cells. It is widely believed that a successful scaffold should mimic the main properties and structure of the extracellular matrix of the tissue of interest. The fibrous nature of the natural extracellular matrix (ECM) has led many researchers to focus on the development of fiber-based scaffolds. Electrospinning has emerged as a very promising technology enabling to produce synthetic polymeric ultrafine fibers. These fibers in mesh-like structure have diameters in the submicron range which results in a high surface area-to-volume ratio and high porosity. The meshes have a typically random distribution or, in some special cases, some preferential directions of alignment. Despite the claim similarity to the morphology of natural ECM, the surface chemical properties of electrospun nanofibers must be optimized. It is herein shown that defined plasma treatments are able to improve the proliferation of different cell types (fibroblastic, chondrogenic and osteogenic) when seeded at the surface of those meshes. Bone ECM is a complex ordered hierarchical structure, as a result of the assembling of collagen fibrils at several length scales, ranging from macro to the nanoscale. To test the interest of those morphologies, patterned nanofiber meshes were developed, having areas of uniaxial/parallel alignment and areas of orthogonal/random distribution of fibers. Those patterned nanofiber meshes, not only induced human bone marrow mesenchymal stem cell (hBMSCs) guidance at the early culture periods, but also influence the cell ECM deposition along the predefined fiber direction. Electrospun nanofibrous structures, due to the inherent planar structure, could compromise a successful reconstruction or regeneration of thick tissues. Two alternative strategies are proposed to overcome this limitation and allowing developing complex ordered fibrous structures that may mimic the hierarchical organization of bone. One structure involves aligned microfibers processed by a 3D rapid prototyping technique, intercalated by electrospun nanofiber meshes. Human osteobastic-like cells showed significantly higher proliferation and maturation when dynamically seeded on these hierarchical fibrous scaffolds, adhering preferentially to the nanofiber meshes. The other structure developed is composed by randomly distributed microfibers reinforced by electrospun chitosan nanofibers, processed by melt extrusion and assembled by fiber bonding. The PBS/Cht-based composite scaffolds sustained ECM deposition and mineralization, as suggested by the increased amount of calcium phosphates produced by the hBMSCs under osteogenic induction conditions. Among the very interesting properties of electrospun nanofiber meshes, their morphological similarity to the natural ECM is very attractive for tissue engineering applications. However, the small size of the pores constitutes a limitation for the infiltration of cells into the inner regions of the fibrous scaffold, hindering its application for thicker 3D tissues. Herein, we propose the electrospinning of a dual composition nanofiber mesh to solve the low cell infiltration capacity on random electrospun nanofiber meshes. The production is followed by the selective dissolution of one fraction of the dual mesh to generate open porosity. The obtained meshes showed statistically significant larger pores, without inducing significant alterations on their morphology. Those highly porous meshes allow human osteoblastic cells infiltration into the full thickness of the mesh structure, showing enhanced viability and proliferation. The properties of electrospun nanofiber meshes were also explored as bioactive agent release systems. Based in large surface area of the meshes, the release rate of a drug/bioactive agent may be modulated by the concentration of loading in the system. We intended to promote the release of the bioactive agent close to the cells to maximize its efficacy. An osteogenic differentiation factor, dexamethasone, was incorporated into electrospun nanofiber meshes at different concentrations (5, 10, 15 and 20 wt.% polymer), in a single-step process. The 15 wt.% nanofibrous system was selected for the cell studies because of its typical morphology and the sustained release of a biologically relevant dexamethasone concentration. An increased alkaline phosphatase concentration and deposition of mineralized matrix was observed on dexamethasone releasing nanofibrous system, cultured with hBMSCs in dexamethasone-absent osteogenic differentiation medium, showing the potential of this strategy for bone related applications. We proposed herein different ways to overcome some of the limitations of the electrospun meshes for bone tissue engineering related applications. The strategies enabled showing that, by systematically facing its limitations, we could generate structures that have many more possibilities, enabling also its application in many different problems in the context of tissue engineering and regenerative medicine.Os biomateriais e as estruturas de suporte ao crescimento celular, ou ‘scaffolds’, desempenham um papel importante em inúmeras estratégias de medicina regenerativa e engenharia de tecidos. Esses sistemas são projectados e desenhados a fim de auxiliar e guiar as células durante a regeneração tecidular. De forma a alcançar este objectivo, o ‘scaffold’ deve imitar as propriedades e estrutura da matriz extra-celular (ECM) do tecido alvo. A natureza fibrosa da ECM tem direccionado os investigadores no desenvolvimento de ‘scaffolds’ fibrosos. O ‘electrospinning’ é uma das tecnologias mais promissoras na produção de fibras poliméricas sintéticas ultra-finas. Essas fibras organizadas numa estrutura semelhante a uma malha têm diâmetros sub-micrométricos, resultando numa elevada área de superfície e porosidade. As malhas têm, tipicamente, uma distribuição aleatória ou, em alguns casos especiais, direcções preferenciais de alinhamento. Apesar da similaridade morfológica destas malhas com a ECM nativa, as propriedades químicas da superfície das nanofibras devem ser optimizadas. Demonstra-se nesta tese que tratamentos de plasma específicos podem melhorar a proliferação de diferentes tipos celulares (fibroblasticos, condrogénicos e osteogénicos) quando semeados à superfície dessas malhas. A ECM do osso é uma estrutura hierárquica organizada e complexa, resultante do arranjo espacial de fibrilos de colagénio a diversas escalas, partindo da dimensão nanométrica. Para testar a relevância dessa morfologia, foram desenvolvidas malhas de nanofibras com padrão definidos, contendo áreas de alinhamento uniaxial/paralelo e áreas de distribuição ortogonal/aleatória das fibras. Essas malhas de nanofibras padronizadas induzem não só a orientação de células estaminais mesenquimais de medula óssea humana (hBMSCs) para tempos de cultura curtos, mas também influenciam favoravelmente a deposição de ECM ao longo das fibras com alinhamento predefinido. Estruturas produzidas por ‘electrospinning’, devido à sua estrutura planar, poderão comprometer o sucesso da reconstrução ou regeneração de tecidos espessos. Duas estratégias alternativas foram aqui propostas para ultrapassar esta limitação e permitir o desenvolvimento de estruturas fibrosas ordenadas complexas que podem recapitular a organização hierárquica do osso. Uma estrutura envolve microfibras alinhadas processadas por uma técnica de prototipagem tridimensional, intercaladas por malhas de nanofibras produzidas por ‘electrospinning’. Células osteoblásticas humanas demonstraram niveis de proliferação e maturação significativamente mais elevadas, quando semeadas dinamicamente nesses ‘scaffolds’ fibrosos hierárquicos, aderindo preferencialmente às malhas nanofibrosas. Uma outra estrutura desenvolvida é composta por microfibras aleatoriamente distribuídas reforçadas por nanofibras de quitosano produzidas por ‘electrospinning’, processadas por extrusão e aglomeradas por compressão a quente. Estes ‘scaffolds’ compósitos à base de PBS/Cht reforçados sustentam uma acrescida deposição de ECM e mineralização, como sugerido pelo aumento de fosfatos de cálcio produzidos pelas hBMSCs cultivadas em condições de indução osteogénica. A semelhança morfológica das malhas de nanofibras com a ECM é muito atraente para várias aplicações em engenharia de tecidos. No entanto, a pequena dimensão dos poros constitui uma limitação à infiltração de células, prejudicando a sua aplicação na geração de tecidos mais espessos. Nesta tese, propõe-se a produção de uma malha nanofibrosa com dupla composição para solucionar a baixa capacidade de infiltração celular em malhas aleatórias. A subsequente dissolução selectiva de uma das fracções da malha permite obter maiores porosidades. As malhas obtidas demonstraram um aumento estatisticamente significativo do tamanho dos poros, sem alteração da sua morfologia. Demonstrou-se que estas malhas altamente porosas permitem a infiltração das células osteoblásticas humanas em todo o volume da sua estrutura, apresentando maior viabilidade e proliferação celular. As malhas produzidas por ‘electrospinning’ foram também exploradas como sistemas de libertação de agentes bioactivos. Pretendia-se uma libertação do agente bioactivo directamente na vizinhança das células, de modo a maximizar a sua eficácia. Um componente indutor da diferenciação osteogénica, dexametasona, foi incorporado nas malhas nanofibrosas em diferentes concentrações (5, 10, 15 and 20 wt.% polymer), num passo único. A concentração de fosfatase alcalina e a deposição de matriz mineralizada aumentadas foram observadas em sistemas nanofibrosos com libertação de dexametasona cultivados com hBMSCs em meio de diferenciação osteogénica sem dexametasona, demonstrando o potencial desta estratégia em aplicações ósseas. Neste trabalho propusemos diferentes possibilidades para obviar a importantes limitações das malhas produzidas por ‘electrospinning’ quando aplicadas em estratégias de regeneração de tecido ósseo. Estas estratégias permitiram demonstrar que, encarando sistematicamente essas limitações, foi possível desenvolver estruturas com maiores potencialidades e funcionalidades acrescidas. Estes desenvolvimentos podem ainda estender o seu potencial a outras aplicações em engenharia de tecidos e medicina regenerativa.Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) for PhD grant SFRH/BD/24382/2005, the ‘Naturally Nano’ project (POCI/EME/58982/2004) and the European Integrated Project GENOSTEM (LSH-STREP-CT-2003-503161) for the initial scholarship