Seleção de péptidos específicos para células do cancro do colon através do uso de bibliotecas de péptidos expressas na superfície de fagos

Dissertação de mestrado integrado em Engenharia Biológica (área de especialização em Tecnologia Química e Alimentar)Colorectal cancer (CRC), localized to the large intestine and rectum, is the third most commonly diagnosed cancer and the second leading cause of cancer death. At the molecular level, CRC is a heterogeneous disease. This heterogeneity, currently not covered by available screening tests, translates into differences in the disease progression and also in the response to chemotherapeutic agents which proves that there is an undeniable need for improved diagnostic and screening tools capable of distinguish cancer at a molecular level. The main goal of this thesis was the development of a multifunctional phage-based nanoparticle to detect and report the presence of cancer cells on a given sample through the use of a biosensor. Particularly, M13KE phage particle was genetically modified to accomplish a recombinant product capable of recognizing poorly differentiated colon cancer cells (RKO cell line) and report their presence using bioluminescence. The element of this particle that allowed targeting RKO cells was obtained using phage-displayed random peptide libraries to screen the surface of these cells towards the identification of biomarkers (i.e. membrane proteins) and specific peptide ligands. For that purpose, two types of random peptide libraries (presenting seven linear peptides - Ph.D. 7 and twelve linear peptides - Ph.D. 12) were cloned into the genome of the M13KE filamentous phage. Constructed libraries and a commercial one (Ph.D. C7CTM from New England Biolabs®) were used to perform two methodologies of phage display and biopanning in order to find specific peptide ligands with affinity to RKO cells. The affinity of the phage pools obtained through biopanning was assessed using ELISA methodology. As a result of these experiments, a new specific peptide, CIGNSNTLC, with high affinity towards RKO cells was discovered. In order to confer to the phage the ability to produce a bioluminescent signal, the insertion of NanoLucTM gene into the M13KE genome was also attempted, at the 5’ end of gene VIII in order to obtain 2700 copies of NanoLucTM luciferase coupled to pVIII M13KE major coat protein. The presence of this enzyme on the phage would function as a reporter of the presence of a specific biomarker on a given sample and the amount of signal could be related to the amount of that biomarker. In summary, the results herein gathered highlight that phage display is a powerful tool to find new peptide ligands capable of targeting cancer cells. In addition, the construction of a phage particle capable of recognizing and report the presence of biomarkers on a given sample will be a major advance on the use of biosensors for cancer diagnosis.O cancro colorectal, localizado no intestino grosso e no recto, é o terceiro cancro mais diagnosticado e a segunda causa de morte relacionada com doenças oncológicas. O cancro colorectal é uma doença muito heterogénea a nível molecular. Esta heterogeneidade que se traduz em diferenças na progressão da doença e na resposta dos pacientes aos agentes quimioterápicos, não é, atualmente, abrangida pelos testes diagnósticos usados o que prova, inegavelmente, que há uma necessidade de encontrar métodos de diagnóstico mais eficazes e capazes de distinguir esta doença ao nível molecular. O objetivo principal desta tese foi o desenvolvimento de uma nanopartícula fágica multifuncional para detetar e reportar a presença de células cancerígenas numa dada amostra, através do uso de um biossensor. Em particular, foi planeada a modificação do fago M13KE para obter um produto recombinante capaz de reconhecer células pouco diferenciadas do cancro do colon (de uma linhagem celular denominada RKO), e reportar a sua presença através de bioluminescência. O elemento desta partícula fágica que possibilita o reconhecimento das células RKO foi obtido usando bibliotecas de fagos acopladas à cápside da partícula fágica para rastrear a superfície celular destas células e identificar biomarcadores (proteínas membranares) e ligandos específicos. Com esse objetivo, dois tipos de bibliotecas fágicas (com uma sequência peptídica linear de 7 peptidos – Ph.D. 7, e de 12 péptidos – Ph.D. 12) foram geneticamente construídas usando o fago filamentoso M13KE. As bibliotecas construídas, em conjunto com uma terceira biblioteca comercial (Ph.D. C7CTM da New England Biolabs®) foram usadas para proceder a duas metodologias de phage display e biopanning para encontrar ligandos peptídicos específicos com afinidade para as células RKO. A afinidade dos complexos fágicos obtidos através dos ensaios de biopanning foi avaliada através de ensaios de ELISA. Como resultado das atividades experimentais apresentadas descobriu-se uma nova sequência peptídica, CIGNSNTLC, com grande afinidade para as células RKO. Com o objetivo de conferir a capacidade de produzir um sinal luminescente ao fago, tentou-se inserir o gene NanoLucTM no vetor M13KE por forma a conseguir o acoplamento da NanoLuc® luciferase às 2700 cópias da proteína VIII da cápside do fago. Em suma, os resultados desta tese evidenciaram que o phage display é uma ferramenta poderosa para encontrar novos ligandos capazes de reconhecer células cancerígenas. Adicionalmente, a construção de uma partícula fágica capaz de reconhecer e reportar a presença de biomarcadores numa dada amostra será um grande avanço no uso de biosensores para o diagnóstico de cancro