Evaluation and characterization of antioxidant and antigenotoxic properties of Portuguese propolis

Dissertação de mestrado em Biotecnologia e Bio-empreendedorismo em Plantas Aromáticas e MedicinaisO própolis é uma substância produzida pelas abelhas (Apis mellifera L.) após a colheita de brotos e cascas de plantas e pela mistura posterior com a enzima salivar β-glicosidase. As abelhas utilizam o própolis nos seus favos como proteção, para reparar danos, construir locais assépticos para os ovos da rainha, e também como isolante térmico. A composição química do própolis varia geograficamente, com a flora disponível, a época da colheita, e da raça das abelhas. Vários grupos de compostos podem ser encontrados nos extractos de própolis, tais como, polifenóis, terpenóides, esteróides e aminoácidos. Estes compostos têm estado associados a diversas actividades biológicas: antioxidante, antimicrobiana, scanvenger de radicais livres, antigenotóxico/genotóxico e antimutagénico. O própolis português tem sido pouco estudado o que abre a perspectiva da sua valorização económica através da validação cientifica das suas actividades biológicas normalmente atribuídas a amostras de outras origens. Assim, o nosso objectivo prende-se com a análise e estudo do própolis português, nomeadamente no que respeita à sua caracterização química e avaliação das suas actividades biológicas. Uma amostra colhida na Beira Interior (Côa) foi usada para preparar um extracto etanólico de própolis (PEE) para testar em diferentes ensaios utilizando Saccharomyces cerevisiae como modelo biológico. Para investigar o efeito protector do PEE em células de levedura, efectuaram-se ensaios de viabilidade com peróxido de hidrogénio (H2O2). Para avaliar o efeito antigenotóxico de PEE usouse o ensaio cometa e para verificar a sua actividade antioxidante intracelular usou-se citometria de fluxo. A amostra de própolis foi analisada quimicamente para quantificar o teor em polifenóis totais e flavonóides, e os métodos de DPPH e ABTS foram usados para demonstrar a actividade antioxidante in vitro. Os nossos resultados sugerem que o própolis português tem capacidade antioxidante quando avaliada pelo ensaio DPPH (in vitro) e por citometria de fluxo (in vivo). Do mesmo modo, a viabilidade celular da levedura aumentou, tanto em condições de pré-incubação e co-incubação, na presença de um agente oxidante (H2O2). No entanto em incubações prolongadas de células com PEE observamos um decréscimo da viabilidade. O ensaio cometa sugere que o PEE tem efeito antigenotóxico, ao proteger o DNA contra stresse oxidativo, e genotóxico quando usado sozinho na incubação de células. Para além da acção antioxidante, estes resultados sugerem uma acção pró-oxidante do PEE.Propolis is a substance produced by bees (Apis mellifera L.) after harvest of buds and bark of plants and by subsequent mixing with the salivary enzyme β-glucosidase. Bees use propolis in their combs as protection, to repair damage, to build aseptic locals for the eggs of the queen, and also as a thermal insulator. The chemical composition of propolis varies geographically, with the available flora, the time of collection and the race of the bees. Different group of compounds can be found in propolis extracts, such as polyphenols, terpenoids, steroids and amino acids. These compounds have been associated with diverse biological activities: antimicrobial, antioxidant and scavenger of free radicals, antigenotoxic and genotoxic, antimutagenic. Portuguese propolis has been insufficiently studied, which possibilitates the opportunity for its economic valorization by scientifically support the biological activities commonly assigned to samples from other origins. Thus, our objective relates to the analysis and study of Portuguese propolis, particularly in what concerns chemical characterization and evaluation of biological activities. A sample collected in Beira Alta (Côa) was used to prepare an ethanol extract (PEE) and this extract was tested in different assays, using Saccharomyces cerevisiae as biological model. To investigate the protector effect of PEE in yeast cells, viability assay was made using hydrogen peroxide (H2O2). Comet assay was made to evaluate the antigenotoxic effect of PEE and flow cytometry to verify the antioxidant activity. The sample was analyzed chemically to quantify total polyphenolic and flavonoids content, and DPPH and ABTS to demonstrate the antioxidant activity in vitro. Our results suggest that Portuguese propolis has antioxidant capacity when assessed by the DPPH assay (in vitro) and flow cytometry (in vivo). Accordingly, viability has improved when propolis was assayed, either by pre-incubation or co-incubation with yeast cells shocked with an oxidant agent (H2O2). However, prolonged incubation of cells with high concentrations of PEE promoted decrease of viability. Results obtained by the comet assay suggest that PEE has antigenotoxic activity, protecting the genome against oxidative stress, and genotoxic effect when used alone in incubation of yeast cells. Besides the antioxidant activity, we provide results suggesting a prooxidant activity of PEE