Rintasyövän diagnostiset määritysmenetelmät

Opinnäytetyön tarkoituksena oli kehittää herkkä määritysmenetelmä rintasyövän diagnosointiin soluista vapautuvalle prostata-spesifiselle antigeenille (PSA). Opinnäytetyö tehtiin Turun yliopiston biolääketieteen laitoksella ja se oli osa laajempaa EU-projektia. Työssä käytettiin analyyttina PSA:ta, jonka pitoisuus on koholla eturauhassyövän yhteydessä, mutta tutkimukset ovat osoittaneet sitä löytyneen rintasyövän yhteydessä naisilla. Työssä vertailtiin kahta eri menetelmää ja niiden herkkyyksiä havaita PSA:ta. Heterogeenisessä, ei-kilpailevassa määrityksessä vasta-aine H117 sitoutuu mikrotiitterilevyn kaivon pohjaan. Vasta-aineeseen sitoutuu PSA ja tähän sitoutuu toinen vasta-aine 5A10, joka on sitoutunut europiumilla leimattuun nanopalloon. Tässä muodostuu niin kutsuttu sandwich. Ainoastaan sitoutuneiden kompleksien fluoresenssi mitataan, joten menetelmä vaatii pesuja välissä, jotta sitoutumaton aine saadaan pois. Saatu fluoresenssisignaali oli suoraan verrannollinen analyytin määrään. Toinen menetelmä, jota tutkittiin, oli kaksoisfotoniviritykseen perustuva menetelmä TPX. TPX-teknologia perustuu polymeeristen mikropallojen käyttöön kiintokantajana reaktiossa ja fluoresoivien molekyylien kaksoisfotoniviritykseen rajatussa kolmiulotteisessa fokuksessa. Tässä fluoresoivana aineena käytettiin BF530-väriä. Tässä menetelmässä vasta-aineella H117 koutattuihin mikropalloihin liittyi analyytti PSA, johon liittyi vasta-aine 5A10, joka oli sitoutunut BF530:lla värjättyyn nanopalloon. Ainoastaan sitoutuneet kompleksit mitattiin TPX-laitteella. Analyytin määrä oli suoraan verrannollinen mittauksessa saatavaan fluoresenssisignaaliin. Menetelmien herkkyyttä parannettiin optimoimalla käytettyjen vasta-aineiden ja mikropallojen määrä sekä puskuri. Määritykset tehtiin solun kasvatusmediasta otetuille näytteille, joten työssä tutkittiin, miten eri solun kasvatusmediumit ja solutiheydet vaikuttavat menetelmän herkkyyteen.The aim of this thesis was to develop a sensitive assay for breast cancer detection. The project was carried out at the Faculty of Medicine of the University of Turku as part of a larger EU study. The analyte in this study was PSA. Its concentration in blood is elevated when a person has been diagnosed with prostatic cancer but according to recent studies, blood PSA levels are also elevated in some women with breast cancer. Two different methods were used in this thesis. In a heterogenic, non-competitive assay the primary antibody H117 binds to the bottom of a microtitration plate well. PSA binds to this antibody and the secondary antibody 5A10 which is bound to europium-labeled nanoparticles binds to the PSA. These form a so called sandwich. Only the fluorescence of the bound complexes is measured so this method requires washes during the procedure to remove the unbound material. The received fluorescence is directly proportional to the amount of the analyte. The other examined method was based on TPX technology. This technology is based on the use of microspheres as solid-phase reaction carrier and on two-photon excitation of fluorescent molecules which takes place only within the three-dimensional focal volume. The fluorescent agent in this method was BF530. PSA was bound to the microspheres coated with antibody H117. This complex was then bound to the nanospheres coated with antibody 5A10 and labeled with BF530. Only the bound complexes were measured using a TPX fluorometer. The amount of the analyte was directly proportional to the received fluorescence signal. The sensitivity of the methods was improved by optimizing the amounts of the antibodies and microspheres used. The buffers used were compared and the one that gave the best signals was selected. The assays were made from the samples obtained from the medium of the cells. Thus, the effects of the different cell-culture media and cell concentration on the sensitivity of the methods were studied