OPTIMALISASI AMPLIFIKASI PCR UNTUK ISOLASI GEN FUSI cbm-lcc2 DARI pET30a REKOMBINAN

Lakase merupakan enzim yang mengkatalis degradasi lignin dengan cara oksidasi. Carbohydrate Binding Module (CBM) merupakan komponen penting dalam sisi aktif enzim yang dapat meningkatkan aktivitas enzim. Gen cbm-lcc2 telah terinsersi pada plasmid pET30a dan diekspresikan Escherichia coli BL21. Namun, masih diperlukan optimalisasi untuk ekspresinya. Penelitian ini bertujuan untuk mengoptimalisasi isolasi dan amplifikasi gen cbm-lcc2 dari pET30a dalam Escherichia coli TOP10 sebagai langkah awal proses subkloning. DNA template yang digunakan pada penelitian ini adalah pET30a-cbm-lcc2. Metode isolasi meliputi metode Polymerase Chain Reaction (PCR), pemurnian dan sekuensing. Proses PCR dilakukan menggunakan enzim Taq Polimerase dan Pfu Polimerase. PCR dilakukan sebanyak 30-35 siklus pada kondisi denaturasi 95ºC, annealing 53-63ºC dan extension 72ºC. Amplikon PCR dianalasis dengan metode sekuensing untuk mengetahui bahwa gen cbm-lcc2 yang akan diklon ke dalam pET32a telah terisolasi dan memiliki tingkat homologi 99% gen cbm-lcc2 dari pET30a