Molekularbiologische Charakterisierung des Membranankers des Yersinien-Adhaesins YadA

Nach wie vor spielen die von enteropathogene Yersinien hervorgerufenen Erkrankungen eine wichtige Rolle im Bereich der gesamten klinischen Medizin. Neben akuten Erkrankungen (Yersiniosen), die vor allem bei Kleinkindern, alten und abwehrgeschwächten Patienten vorkommen, sind es auch die verschiedenen immunologischen Folgeerkrankungen, wie Arthritiden oder das Reitersyndrom, die im besonderen Yersinia enterocolitica in den Fokus des wissenschaftlichen Interesses rücken und eine molekularbiologische Analyse der Infektionsmechanismen nötig machen. Eine besondere Bedeutung kommt dem hochkonservierte Virulenzplasmid pYV zu, das für ein TypIII- Proteinsekretionssystem und für das Yersinien Adhäsin YadA (Autotransporter, TypV-Sekretionssystem) kodiert. YadA ist der Prototyp einer Gruppe von Autotransportern, deren struktureller Aufbau sich von allen anderen bisher bekannten Autotransporterklassen unterscheidet, vor allem im Bereich des Membranankers, des Teils also, der für den Einbau des Proteins in die Membran, den Transport der funktionellen Domäne durch die Membran, die Oligomerisierung und die Stabilität des Gesamtproteins verantwortlich ist. Auf Grund dieser aus molekularbiologischer Sicht zentralen Rolle, die der Membrananker für das Funktionieren des Adhäsins und Autotransports von YadA spielt, war es das Ziel der vorliegenden Arbeit mehr über die Topologie und strukturellen Eigenschaften sowie des Oligomerisierungs- und Transportmechanismus dieser C-terminalen Domäne von YadA in Erfahrung zu bringen. Der Membrananker selbst besteht aus vier C-terminalem ß-Faltblättern (Anker-Bereich) sowie dem N-terminalem linker-Bereich, der Verbindung zur funktionellen Passagierdomäne herstellt. In den linker-Bereich von N-terminal verkürzten YadA-Mutanten wurden FLAG-Sondensequenzen einkloniert, die mit speziell an diese FLAG-markierten Bereiche bindenden monoklonalen Antikörper nachgewiesen werden können und so eine Aussage über extrazelluläre oder intrazelluläre lokalisierte Domänen möglich machen. Die Ergebnisse dieser Versuche legen nahe, dass nahezu der gesamte linker-Bereich innerhalb der Membran, also der vom Ankerbereich gebildeten transmembranösen Pore, befindet. Weiterhin wurde versucht, mittels Cystein-Scanning-Mutagenese die FLAG-Experimente zu bestätigen, was nicht gelang, weil die eingefügten Cysteinreste in YadA nicht spezifisch mit Biotinmalleimid reagierten. In einem weiteren Versuch wurde der gesamte YadAMembrananker gegen Membrananker anderer Mitglieder der Oca-Familie (UspA1 von Moraxella catarrhalis, EibA von Escherichia coli, Hia von Haemophilus influenza)ausgetauscht. Es stellte sich heraus, dass alle so hergestellten YadA-Hybridproteine exprimiert und an der Bakterienoberfläche exponiert werden. Jedoch zeigten sich Unterschiede bei der Funktionalität der Hybridadhäsine, vor allem in der Serumresistenz, der Autoagglutination und der Oligomerenstabilität. Die durchgeführten Untersuchungen bestätigen das bestehende Modell des YadAMembranankers als Autotransporter und unterstützen die Einteilung von YadA, EibA, UspA1 und Hia in eine einheitliche Klasse von Autotransportern, die als Oca-Familie bezeichnet wird. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die N-terminale YadAPassagierdomäne von unterschiedlichen Autotransporterdomänen über die äußere Bakterienmembran transloziert wird