Development of a molecular technique to evaluate HGV/GBV-C viral load in HIV-1 co-infected patients

Introdução: A infecção pelo HGV/GBV-C é comum em humanos e pode persistir por anos sem apresentar sintomas clínicos evidentes. O HGV/GBV-C é um membro da família Flaviviridae, que possui RNA de fita simples com polaridade positiva, e é fortemente relacionado ao vírus da Hepatite C (HCV). Estudos recentes sugerem que a infecção pelo HGV/GBV-C em pessoas HIV-positivas está associada com uma progressão mais lenta para a AIDS, indicando uma menor carga viral do HIV e uma maior contagem de células T CD4+ nesses indivíduos, embora muitos estudos tenham falhado em demonstrar tais efeitos benéficos. Objetivos: Padronização da técnica de PCR em Tempo Real para estimar a prevalência e a carga viral do HGV/GBV-C entre os pacientes infectados pelo HIV, comparando os pacientes que apresentam infecção somente pelo HIV e os co-infectados pelo HGV/GBV-C em termos de carga viral do HIV e contagem de células T CD4+. Métodos: A região genômica do HGV/GBV-C escolhida para o desenvolvimento do estudo foi a 5’UTR. Foi necessária a realização de uma clonagem molecular para obtenção de um plasmídeo recombinante e produção de grande quantidade deste por meio de uma transformação bacteriana em cepa DH10B. O plasmídeo recombinante foi linearizado e submetido à transcrição in vitro para obtenção e quantificação de RNA sintético para a construção da curva de quantidicação absoluta do sistema da PCR em Tempo Real. Os pacientes foram submetidos ao ensaio e seus resultados comparados à curva padrão para obtenção das cargas virais. Resultados: Uma diluição seriada em fator 10 do RNA sintético produziu uma curva de quantificação com 9 ordens de magnitude, numa faixa de 102 a 1010 genômas equivalentes/ul. Para o ensaio, a inclinação da reta foi de -3,56, o intercepto foi de 45,56, o coeficiente de correlação de Pearson foi de r2 = 0,99 e a eficiência da reação foi de 90,9%. A reprodutibilidade do teste foi avaliada com base numa reação em quadruplicata da curva de quantificação com média de coeficiente de variação de 1,2%. Foram incluídos 102 pacientes no estudo, onde 57,8% do sexo masculino e com média de idade de 42±9 anos. Do total, 21% dos pacientes eram positivos para a presença de RNA de HGV/GBV-C no plasma com média de carga viral de 300.455 cópias/mL, e para o anticorpo anti-E2, 26,4% eram positivos. Não houve diferença estatística quanto às médias de carga viral do HIV-1 e contagem de células T CD4+ quando comparados pacientes infectados somente pelo HIV, co-infectados pelo HGV/GBV-C ou com presença de anticorpos anti-E2. Houve fraca correlação negativa quando comparadas as cargas virais do HIV e do HGV/GBV-C. Conclusões: A padronização da técnica de PCR em Tempo Real pôde ser realizada e está de acordo com dados de outros trabalhos realizados na mesma área. Assim como descrito na literatura, existe alta prevalência de infecção pelo HGV/GBV-C entre os indivíduos infectados pelo HIV (21%). A fraca correlação negativa entre as cargas virais do HIV e do HGV/GBV-C confere com dados da literatura podendo sugerir efeito benéfico em relação à progressão para a AIDS, entretanto, outros fatores também podem estar relacionados e mais estudos nessa área são necessários para melhor entendimento dessa interação viral.Introduction: The HGV/GBV-C infection is frequent in humans and could last for years without evident clinical symptoms. HGV/GBV-C is a member of the Flaviviridae family strongly associated with the hepatitis C virus and composed by a single positive RNA strain. Recent studies suggest that HGV/GBV-C infection in HIV seropositive patients is associated with a delayed progression to AIDS, lower HIV viral load and a higher CD4 T-cell count, however, some studies failed to demonstrate such beneficial effects in these patients. Objectives: The aim of this study was to standardize a real time PCR to estimate the prevalence and HGV/GBV-C viral load among the HIV seropositive patients, comparing HIV monoinfected and co-infected in terms of T CD4 cell count and HIV viral load. Methods: To achieve this purpose, the 5’UTR genomic region of HGV/GBV-C was selected. A molecular cloning was needed in order to obtain a recombinant plasmid and a high production of this plasmid through a bacterial cloning in DH10B strain. The recombinant plasmid was linearized and submitted to in vitro transcription to obtain and to quantify synthetic RNA to construct the absolute quantification curve of the real time PCR system. The patient samples were submitted to the assay and the results were compared to the standard curve in order to obtain the HGV/GBV-C viral load. Results: A serial dilution of the synthetic RNA in factor 10 produced a quantification curve with 9 orders of magnitude, varying from 102 to 1010 genome equivalent/µL. To the assay, the inclination of the straight line was -3.56, the intercept was 45.56, the Pearson correlation coefficient was r2 =0.99 and the efficiency of the reaction was of 90.9%. The reproducibility of the assay was evaluated based on a quadruplicate reaction of the quantification curve with a mean coefficient of variation of 1.2%. 102 patients were included in the study, mean age of 42±9 years and 57.8% of them were man. From the total cohort, 21% were positive to HGV/GBV-C RNA in the plasma, with a mean viral load of 300.455 copies/mL and 26.4% were positive to anti-E2 antibodies. There were no statistical significance in regard to the CD4 T-cell count and HIV viral load when comparing HIV monoinfected patients with that co-infected with HGV/GBV-C (p=0,297)and a weak negative correlation was observed between HIV and HGV/GBV-C viral loads (Spearman’s= -0,237). Conclusions: The standardization of the real time PCR could be done and is in agreement with other published studies. According to the literature data, there is a high prevalence of the HGV/GBV-C infection among HIV seropositive patients. The weak negative correlation between HIV and HGV/GBV-C viral load is in agreement with previous publications, suggesting a beneficial effect regarding to AIDS progression, however, other factors can be associated and future studies are needed to better understand this viral interaction.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)FAPESP: 05/57611-5BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe