Duplo papel da amastina durante a invasao celular de amastigota extracelular e multiplicacao intracelular do Trypanosoma cruzi in vitro e in vivo

No intuito de selecionar moleculas que estivessem envolvidas na invasao celular foi utilizado o microarranjo de cDNA de amastigotas extracelulares das cepas G e CL de Trypanosoma cruzi, que identificou a P21 como um possivel modulador positivo da infectividade da cepa G. Contudo, ainda nao havia sido investigada a possivel existencia de moduladores negativos da invasao que poderiam ser mais abundantes nos amastigotas menos infectivos (cepa CL). Na analise do microarranjo foi identificada uma glicoproteina de superficie, altamente expressa nos amastigotas, denominada amastina; uma de suas copias e 21 vezes mais expressa na cepa CL. Aventou-se assim a possibilidade de que esta proteina estaria relacionada com a modulacao negativa da invasao celular dessas formas. Desta forma, com o objetivo de determinar a funcao da amastina no ciclo de vida do parasito decidimos clonar, expressar e purificar a regiao menos hidrofobica da amastina em fusao com GST, para producao da proteina de fusao GST-AmastinaH contra a qual se produziu um anticorpo policlonal em coelho. Este possibilitou a imunolocalizacao da amastina nos amastigotas de T. cruzi e confirmou sua localizacao na membrana do parasita. A proteina recombinante foi capaz de aderir a celulas HeLa de forma dose-dependente e saturavel, e quando celulas HeLa foram pre incubadas com 5 μg/ml de proteina recombinante observamos uma diminuicao da invasao celular pelas formas AE. Para confirmar o papel da amastina no ciclo celular dos amastigotas de T. cruzi, parasitas da cepa G foram transfectados com os vetores pTREX-amastina-GFP e pTREX-GFP (controle), por meio do qual foi verificada uma significativa diminuicao na invasao celular dos AE que super-expressam a amastina em relacao ao controle. Entretanto, o numero de tripomastigotas liberados no sobrenadante das celulas HeLa infectadas 96h e 120h apos a invasao foi maior nas celulas infectadas com os parasitas que super expressam a amastina. Experimentos in vivo sugeriram que a amastina esta relacionada com a maior taxa de multiplicacao dos AEs de T. cruzi. Como resultado, a amastina pode compensar a menor taxa de infectividade e proporcionar um ambiente mais propicio para a multiplicacao e diferenciacao do parasita proporcionando uma infeccao patenteBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe