Investigation of the metastatic behavior of osteosarcoma through analysis of gene expression and genomic alterations

Introdução: O osteossarcoma (OS) e um tumor osseo maligno de alta capacidade metastatica e tem o pulmao como seu sitio preferencial de metastase. Apesar de o OS ser o tumor osseo mais frequente em criancas e adolescentes, pouco se conhece sobre os eventos relacionados ao seu processo metastatico. Alem disso, existem relativamente poucos estudos de estabelecimento e caracterizacao de culturas celulares de metastases de OS. Objetivos: Analise quantitativa do nivel de expressao dos genes RB1, RANKL, MDM2, OSTERIX, MMP9 e CXCR4 em metastases de OS. Investigacao das regioes 12q14 (MDM2), 13q14 (RB1) e 8q24 (MYC-C) em culturas celulares de metastases pulmonares de OS, atraves de hibridacao in situ fluorescente (FISH). Caracterizacao da linhagem celular M-OS estabelecida a partir de uma metastase pulmonar de OS, atraves de citogenetica convencional, FISH e imuno-histoquimica. Metodos: A amostra para analise de expressao foi composta por 74 metastases de OS (39 metastases de pacientes metastaticos e 35 metastases de pacientes nao metastaticos ao diagnostico), 24 OS primarios livres de tratamento, 30 pulmoes adjacentes as metastases, 11 ossos normais e dois pulmoes normais. Para o gene MMP9, foi feita uma analise de expressao adicional em 72 amostras de sangue periferico (SP) de pacientes com OS (30 SP pre-quimioterapia e 42 SP pos-quimioterapia) e em nove individuos saudaveis. A expressao foi determinada pela quantificacao do mRNA atraves de PCR quantitativa em tempo real. Para a analise de FISH foram avaliadas 12 amostras de culturas primarias de metastases pulmonares de OS. Resultados: As amostras de OS primario apresentaram baixa expressao de RANKL e altos niveis de mRNA dos genes MDM2 e MMP9. Em metastases de pacientes metastaticos ao diagnostico, foram detectados baixos niveis de expressao dos genes RB1 e RANKL, com alta expressao dos genes MDM2 e CXCR4. As amostras de pulmoes adjacentes as metastases apresentaram elevada expressao dos genes RANKL, CXCR4 e MMP9. Niveis elevados de expressao do gene MMP9 foram detectados no sangue periferico dos pacientes com OS antes do tratamento quimioterapico. Apos o periodo de quimioterapia e o final do tratamento, os niveis de MMP9 detectados no sangue dos pacientes diminuiram significativamente. O aumento de expressao de MMP9 no sangue se relacionou com uma pior sobrevida dos pacientes com OS. A analise por FISH das culturas primarias de metastases pulmonares de OS mostrou que a delecao de RB1 e amplificacao de MDM2 nao foram eventos frequentes. Entretanto, a amplificacao de MDM2 foi um evento exclusivo das metastases de pacientes metastaticos ao diagnostico. Alem disso, o ganho no numero de copias dos genes MDM2 e MYC-C nas metastases de OS apresentou impacto negativo na sobrevida dos pacientes. Apos 50 passagens in vitro, a caracterizacao citogenetica da linhagem M-OS revelou padroes hiper-diploide e tetraploide de cariotipos. A caracterizacao por imuno-histoquimica de M-OS confirmou a origem osteogenica e a manutencao do fenotipo mesenquimal, mesmo apos o estabelecimento in vitro dessa linhagem celular. Discussao e Conclusoes: Estudos mostraram que a perda de marcadores de osteoclastogenese esta relacionada a uma pior evolucao de pacientes com OS. Em nosso estudo, a perda de expressao do gene RANKL parece estar relacionada com os eventos iniciais que definem o comportamento metastatico do OS, uma vez que os baixos niveis de RANKL sao exclusivos de amostras de OS primario de pacientes metastaticos ao diagnostico e se mantem nas metastases tardias desses pacientes. Os genes CXCR4 e MMP9 estao fortemente relacionados com o direcionamento pulmao-especifico de metastases. O gene CXCR4 apresentou maior expressao nas amostras de metastases de pacientes metastaticos ao diagnostico, sugerindo o envolvimento da via CXCR4/CXCL12 de direcionamento por quimocina nas metastases de OS. O gene MMP9 se mostrou altamente expresso nas amostras de OS primario, pulmoes adjacentes as metastases e sangue periferico pre-quimioterapia, indicando que MMP9 possivelmente participe do direcionamento de metastases para o pulmao e na preparacao do tecido pulmonar pre-metastatico e tambem que sua expressao aumentada no sangue esta associada a uma pior sobrevida dos pacientes com OS. O gene MDM2 regula negativamente a acao do supressor tumoral TP53, alem de participar durante a diferenciacao osteoblastica. O ganho de expressao de MDM2 nas amostras de OS primario e metastases de pacientes metastaticos ao diagnostico sugere a participacao desse gene durante os eventos iniciais de tumorigenese e no estabelecimento metastatico do OS. Alem disso, a analise por FISH mostrou que o ganho no numero de copias de MDM2 nas amostras de metastases pulmonares esta relacionado a baixa sobrevida dos pacientes com OS. Os achados mostraram que as metastases de pacientes metastaticos ao diagnostico apresentam perfil de expressao diferente das metastases de pacientes nao metastaticos ao diagnostico, sugerindo que os eventos que garantem o desenvolvimento de metastases de OS concomitante ao desenvolvimento do tumor primario, possivelmente acontecam nos estagios iniciais do processo de tumorigenese. Alem disso, a nova linhagem M-OS estabelecida a partir de metastase pulmonar de OS podera no futuro ser utilizada em modelos funcionais para investigacao dos mecanismos de metastase do OSBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe