Effects of metalloproteinas from Brotrops leucurus venon and brown spiders venoms on endothelial cell and components of extracellular matrix

A nova metaloprotease fibrinolítica isolada do veneno de Bothrops leucurus, denominada leucurolisina-a (23kDa), apresenta-se como um componente de significativo potencial terapêutica para o tratamento de distúrbios de coagulação, pela sua capacidade de dissolução de trombos. A caracterização dessa enzima mostrou similaridade de seqüência com outras metaloproteases de veneno de cabra que pertencem à classe P-I, além de exibir o sítio catalítico consenso para ligação do íon zinco. É destituída de atividade hemorrágica. Além de fibrinolítica, a enzima mostrou atividade também sobre fibronectina e fibrinogênio. No entanto, a laminina, não foi degradada pela protease, assim como o colágeno I. A protease inibiu a agregação plaquetária induzida por ADP de maneira dose dependente. O efeito citotóxico da leuc¬a sobre células endoteliais em cultura pôde ser observado apenas quando a exposição ocorreu em tempos prolongados e com altas concentrações da metaloprotease. Quando nessas condições, as células expostas alteram a sua morfologia por uma diminuição da adesão, tornando-se arredondadas e culminando no desprendimento lotal do substrato. Não houve redução da viabilidade das células endoteliais expostas à leuc-a em concentrações moderadas. Quando a sua concentração e tempo de exposição foram aumentados de maneira significativa, as células desprendidas perderam sua estabilidade estrutural, o que resultou na lise de parte delas. A atividade do veneno total de B. leucurus sobre as células endoteliais foi similar à leuc-a, porém numa intensidade muito maior. Outra metaloprotease purificada do veneno de Bothrops leucurus pelo grupo foi uma enzima pertencente à classe P-III das metaloproteases de venenos de serpentes (55 kDa). Resultados preliminares mostram uma atividade hemorrágica intensa por parte dessa protease. Análises do perfil proteolítico dessa nova metaloprotease caracterizaram-na com uma potente α-fibrinogenase. A metaloprotease de 55 kDa não mostrou atividade proteolítica sobre laminina e degradou apenas parcialmente colágeno IV. No entanto, mostrou atividade bastante potente sobre a entactina. Análises da atividade dessa protease sobre os colágenos do tipo I e IV mostraram apenas degradação parcial. No entanto, quando testada sobre gelatina essa protease de massa molecular aproximada de 55 kDa comporta-se com uma gelatinase. Diversas metaloproteases também já foram isoladas e caracterizadas nos venenos de aranhas marrons (gênero Loxosceles). Quando células endoteliais em cultura foram expostas ao veneno do L. intermedia observou-se uma profunda alteração na morfologia dessas células, tornando-se arredondadas e com longas filopodia sendo projetadas da periferia da célula. A marcação dos filamentos de actina e da vinculina por fluorescência, mostrou a desorganização do citoesqueleto e reorganização dos pontos de adesão focal, eventos estes que acontecem simultaneamente com as mudanças morfológicas observadas. Houve diminuição do perfil de adesão das células sobre fibronectina após exposição ao veneno de L. intermedia. Além disso, a imunomarcação da fibronectina na matriz extracelular das células em cultura expostas ao veneno confirmou a atividade fibronectinolítica do veneno. Esse resultado, junto com a observação da ligação direta do veneno à superfície celular, pode explicar a citotoxicidade induzida pelo veneno sobre as células endoteliais.BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe