In vitro evaluation of the correlation between cellular activaction and HIV-1 genetic variability.

A pandemia de HIV / Aids tem sido um dos maiores desafios de Saúde publica dos ultimos 25 anos, dada a complexidade de seu agente etiologico e a rapidez com que produz novos casos. A variabilidade genetica do HIV e um dos topicos mais relevantes desta infeccao e esta variabilidade genetica resulta de limitacoes de fidelidade intrinsecas ao mecanismo de replicacao viral, acentuados pela alta taxa de replicacao na geracao e eliminacao de particulas virais durante o tempo da infeccao. A transcricao reversa do genoma viral representa uma etapa critica do ciclo biologico do HIV -I e que pode softer a influencia de varios fatores, como por exemplo a oferta de nucleotideos ou o estado de ativacao celular. Este deficit de oferta de nucleotideos no momento da transcricao reversa pode gerar genomas altamente mutados nos quais, a informacao viral se perde como no caso da hipermutacao. Neste estudo propomos estudar in vitro os mecanismos que podem contribuir pela diversidade genetica do HIV nos momentos iniciais da infeccao em celulas mononucleares de sangue periferico (PBMCs) de individuos saudaveis. Para tanto, ofertamos tres diferentes condicoes de infeccao e cultura para o HIV. Na primeira, infectamos PBMe's em repouso e mantivemos em cultura por 48h; na segunda as PBMCs foram infectadas e ativadas simultaneamente e mantida em cultura por 48h; na terceira condicao, as PBMCs foram ativadas 72h antes da infeccao, apos, infectadas e mantidas em cultura por 48h. Utilizando a tecnica do EndPoint PCR, DNA provirais oriundos de cada condicao de cultura foram obtidos e 46 clones deste DNA produzidos. Em seguida, parte do gene pol contendo 1047 bp de todos os clones foi sequenciado e analisado. Nossos resultados mostraram uma alta taxa de substituicoes de nucleotideos ao longo das sequencias analisadas em todas as condicoes de cultura e a existencia de regioes comuns entre estas sequencias, em todas as condicoes, em que ocorrem substituicoes, destacando as regioes entre 200 a 300 pb, 400 a 500 pb, 600 a 690 pb, 800 a 900 pb. Nestas regioes o processo mutacional e intenso, os eventos mutacionais que mais ocorrem sao os de transicao e as substituicoes nucleotidicas mais fteqUentes sao as de G para A. Ha clones hipermutados nas tres condicoes e a taxa mutacional encontrada esta em um intervalo de I,OxlO-3 a 2,lxlO-2, valores muito acima do que os encontrados normalmente. Nossos resultados sugerem uma nova visao dos momentos iniciais da infeccao pelo HIV -I. Estudos complementares poderao nos ajudar a entender de forma coesa os momentos iniciais da infeccao pelo HIV -I que, sem duvida representa um evento crucial na evolucao da doencaHIV/Aids have been one of the major challenges for public health in the last 25 years. The genetic variability of the HIV-1 is one of the most relevant features in the study of HIV-1 infections. The genetic variability is the result of error accumulation during reverse transcription and the high turnover rate of the viral popuulation. Reverse transcription represents a critical stage of the biological cycle of HIV-1, and can suffer the influence of some factors as for example the level of nucleotides or the state of cellular activation. This deficit in nucleotides at the moment of the transcription can generate highly mutates genomes in which, the viral information may be lost as in the case of the hipermutation. In this study we addressed in vitro, the mechanisms that can be responsible for the genetic diversity of the HIV-1 at the initial periods of the infection in mononuclear cells of peripheral blood (PBMC's) of healthy individuals. We offered three different conditions of infection. In the first, we infected resting PBMC's and we kept in culture for 48h; in the second PBMC's were infected and activated simultaneously and kept in culture for 48h; in the third condition, PBMC's were activated 72h before infection and kept in culture for 48h. Using molecular biology techniques, the deriving provirus DNA of each culture condition were isolated, and PCR clones of this DNA were obtained. All clones were sequenced and the pol gene was analyzed. Our results demonstrated an elevated number of nucleotide substitutions in the clones analyzed in all three culture conditions. A pattern in variation was observed in the sequences. We identify a common distribution of substitutions in all analyzed sequences in different culture conditions. Our results suggest a new vision of the initial periods of HIV-1 infection. Complementary studies will be necessary to allow a better understanding of the initial periods of HIV-1 infection which represents a crucial event related to disease progression.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)FAPESP: 02/11425-8FAPESP: 03/05183-4BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe