Rensponse immune cellular in mirine melanoma: identification of tumoral componnents enveloped in functional response of macrophages

Componentes de membrana do melanoma murino B16F10-NEX2 foram capazes de ativar macrofagos peritoneais de camundongos C3H/HeJ e C57BL/6 para a producao de IL-12 e NO. Esses componentes foram obtidos por sonicacao das celulas, extracoes sequenciais com cloroformio/metanol 1:2 e 2:1, cloroformio/ metanol/agua 10:20:8, butanol 9 por cento em agua e as fracoes correspondentes denominadas F1. F2 F3 e F4 respectivamente. A fracao F4 apresentou uma capacidade elevada de ativacao de macrofagos peritoneais murinos, sendo por isso escolhida para etapa de purificacao subsequente, em cromatografia de afinidade, utilizando-se colunas C-18 ou de octyl-Sepharose e eluicao com um gradiente descontinuo de propanol que variou de 10 a 50 por cento. As sub-fracoes eluidas com o gradiente de propanol (10 a 50 por cento) e F4 (nao purificada) foram submetidas a cromatografia de gel filtracao em Sephadex G-100. O perfil de cada fracao foi analisado em gel de SDS-PAGE, podendo-se observar um numero elevado de componentes, nao sendo possivel selecionar um predominante. Em uma dessas eletroforeses, realizada com a fracao F4; foram vistas bandas fortemente coradas, de migracao rapida, que poderiam corresponder a glicolipidios. Para obtencao de maiores quantidades de F4, a linhagem B16F10-NEX2 foi mantida em cultura as celulas foram recolhidas) liofilizadas e submetidas a extracoes sequenciais com solventes organicos e butanol 9 por cento. A fracao F4, a qual e extraida em butanol 9 por cento, foi fracionada atraves de cromatografia de afinidade em coluna de octyl-Sepharose, utilizando-se um gradiente descontinuo de propanol (1050 por cento). As sub-fracoes de F4 foram testadas quanto a sua capacidade de ativacao de macrofagos para a producao de oxido nitrico. A sub-fracao eluida em 40 por cento de propanoi foi a que melhor induziu a producao de oxido nitrico pelos macrofagos. Essa sub-fracao foi submetida a cromatografia de gel filtracao em Sephadex G-100, apresentando dois picos principais. Porem, apenas um dos picos apresentou-se mais definido, demonstrando, possivelmente, uma pureza maior. Os tubos referentes a cada pico foram combinados e sua capacidade de estimular macrofagos a produzir NO foi testada obtendo-se resposta positiva para ambos Contudo, apenas os componentes presentes no pico mais definido foram capazes de ativar macrofagos...(au)BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe