Molecular studies of serine protease inhibitors from cattle tick Boophilus microplus(larvae)

A partir de extratos de larvas e ovos do carrapato Boophilus microplus foram purificados inibidores de serinoproteases (BmTIs) utilizando cromatografia de afinidade em tripsina-Sepharose. Os BmTIs apresentaram massas moleculares entre 6,2 kDa e 18,4 kDa e atividade inibitoria sobre tripsina, HuPK (calicreina plasmatica humana) e elastase de neutrofilos. Utilizando cromatografia de troca-ionica coluna Resource Q, os BmTls foram separados nas formas proteicas denominadas BmTI-A, BmTI-B, BmTI-C, BmTI-D, BmTI-E e BmTI-F. O material nao-retido na cromatografia em coluna Resource Q foi separado em coluna Mono S obtendo-se as formas BmTI-1, BmTI-2, BmTI-3, BmTI-4 BmTI-5, BmTI-6 e BmTI-7. Todas as formas de BmTIs apresentaram atividade inibitoria sobre tripsina com constante de dissociacao (Ki) na ordem de nM. As formas BmTI-A, BmTI-D, BmTI-2, BmTI-3 e BmTI-4, inibem elastase de neutrofilos e HuPK com Ki na ordem de nM. O BmTI-D mostrou ser o melhor inibidor de HuPK e o BmTI-4 mais eficiente para elastase de neutrofilos, com constantes de dissociacao (Ki) de 11,6 nM e 0,2 nM, respectivamente. As formas BmTI-A, BmTI-D, BmTI-2, BmTI-3, BmTI-4 e BmTI6 tiveram as porcoes N-terminais determinadas por sequenciamento automatico de aminoacidos, estas sequencias parciais permitiram a classificacao destes BmTIs dentro da familia dos inibidores de serinoproteases tipo Kunitz de tecido animal. Os BmTIs pos tripsina-Sepharose foram utilizados na imunizacao de bovinos, mostrando acao imunogenica (producao de anticorpos anti-BmTIs) e protetora contra a infestacao por esta especie de carrapato. Na tentativa de clonar o gene de um BmTI foram utilizadas duas estrategias de clonagem baseadas na sintese do cDNA a partir do RNA mensageiro de larvas do carrapato 8. microplus. 1) A construcao de uma biblioteca de...(au)BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe