Identification of pathogenic yeasts in clinical samples using RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)

A identificação rápida e confiável de espécies diferentes do gênero Candida tem relevância epidemiológica e terapêutica. A identificação por métodos clássicos muitas vezes é demorada e apresenta resultados inconclusivos. A busca de novas opções na identificação baseada em perfis genotípicos é fundamental para laboratórios de referência. Para abordar este problema, nós avaliamos o desempenho do método de RAPD na identificação de espécies de Candida. Foram avaliadas um total de 78 amostras incluindo espécies de C. albicans, C. tropicalís, C. parapsilosis, C. glabrata e C. krusei. Para a identificação de espécies pelo método convencional, todas as cepas foram submetidas ao microcultivo e posteriormente à análise do perfil bioquímica com auxílio do sistema API 2OC AUX (bioMérieux). A genotipagem foi realizada por técnica de RAPD utilizando-se 3 "primers" diferentes. Numa primeira etapa, padronízou-se o ensaio com amostras de referência ATCC no sentido de obter-se padrões de bandas específicos para cada espécie estudada. Numa segunda etapa, 50 amostras representativas das 5 espécies foram avaliadas por RAPD em ensaio "cego". Um dos "primers", M2, mostrou padrão de bandas intra-específico bem conservado, de aproximadamente 10 bandas cada, variando em tamanho de 2,0 a O,1 kb e bom poder discriminativo de espécies. Para estabelecer-se os padrões de bandas de referência das 5 espécies mais comuns do gênero Candida (C. aíbicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. krusei), foram utilizadas 5 cepas para cada uma delas. Dois perfis genotípicos diferentes foram encontrados entre os isolados de C. parapsilosis. As diferenças obtidas entre estes 2 padrões de bandas foram proporcionais àquelas encontradas entre 2 espécies diferentes de Candida. Quando os Resumo padrões de bandas de referência foram utilizados em experimento "cego" para identificar 50 amostras escolhidas aleatoriamente, incluindo isolados clínicos e cepas ATCC, os resultados do RAPD foram 100 por cento consistentes com os resultados produzidos pelos métodos convencionais. Como métodos ideais de identificação devem ser consistentes com fílogenia e taxonomia, o RAPD foi testado na análise de distâncias genéticas verificadas entre as diferentes amostras. A comparação entre as árvores filogenéticas construídas com os dados do RAPD e com o gene RRNA l8S, mostraram diferenças significativas em suas topologias, indicando que o RAPD não mede corretamente as distâncias relativas...(au).BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe