Structure and proprieties of Bowman-Birk serine proteases inibitors from Dioclea glabra seeds and Kunitz serine proteases inhibitors from Bauhinia rufa

Dioclea glabra e uma leguminosa da subfamilia Papilionoideae, encontrada em todo o Brasil. A presenca, em suas sementes, de uma proteinase (dioclen) e de um especifico inibidor de tripsina, ja foi por nos previamente descrito (Bueno 1994). O inibidor foi purificado das sementes de Dioclea glabra por precipitacao por acetona, fracionamento em troca ionica e filtracao em gel. A estrutura primaria do inibidor, determinada por degradacao de Edman e espectrometria de massa, indicou que o inibidor de tripsina pertence a familia de inibidores Bowman-Birk, contem 67 residuos de aminoacidos e e o primeiro inibidor caracterizado e preparado da tribo Dioclea: SSGPCCDRCRCTKSEPPQCQCQDVRLNSCHSACEACVCSHSMPGLCSC LDITHFCHEPCKSSGDDED Embora o inibidor apresente dois sitios reativos determinados por clivagem especifica por tripsina (Lys 13 His4o), foi demonstrado que apenas o primeiro sitio, com Lys 13 em Pl, se mostrou efetivo. DgTI forma complexo 1:1 com tripsina, com constante de dissociacao Ki O,5 x lO-9 M; e nao foi observada inibicao para quimotripsina, calicreinas, plasmina e trombina. Apesar da alta especificidade para a tripsina, DgTI tambem inibiu a atividade proteolitica de Musca domestica (Diptera) e Tenebrio molitor (Coleoptera). As caracteristicas estruturais e inibitorias do DgTI nos permitem classifica-lo como o primeiro inibidor de Bowman-Birk tipo I descrito para dicotiledoneas. Dioclen e uma endoproteinase com massa molecular de aproximadamente 60 kDa e que criva Arg na posicao Pl. Embora sua acao dependa da presenca metais, as inibicoes por TPCK, TLCK e DFP permitem caracterizar a enzima tentativamente como membro da familia de serinoproteinases. Dioclen hidrolisa proteinas nativas das sementes de Dioclea glabra, inclusive o inibidor DgTI; n entanto, a enzima nao e afetada por esse inibidor. Neste trabalho tambem foram caracterizados 2 inibidores com massa molecular de aproximadamente 20 kDa, das sementes de Bauhinia rufa. A proteinas apresentaram diferentes especificidades para a inibicao das serinoproteinases. BrTI-l e BrTI-3 foram inibidores efetivos de tripsina, mas somente BrTI-3 apresentou atividade inibitoria tambem para fator Xa (Ki 3,5 nM) e calicreinas teciduais (Ki 1,5 nM e 19 nM), calicreina pancreatica de porco e urinaria humana, respectivamente. A sequencia de aminoacidos de BrTI-l foi parcialmente determinada. A proteina e formada por cadeia polipeptidica unica e nao apresenta residuo de cisteina. A sequencia apresenta alta ...(au)BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe