Purificacao e caracterizacao parcial de aminopeptidase do homogenato de rim de coelho

As aminopeptidases estao amplamente distribuidas tanto no reino animal como no vegetal e sao capazes de hidrolisar ligacoes peptidicas na porcao amino-terminal de peptideos, alem de hidrolisar aminoacil-β-naftilamidas (AA-NA) e aminoacil-p-nitroanilidas (AA-Nan). Do homogenato de rim de coelho, tratado com Triton X-100, foram purificadas, por cromatografia de troca ionica e gel filtracao, tres aminopeptidases distintas: a primeira nao retida na coluna de DEAE-celulose Cellex D, equilibrada com tampao fosfato de sodio 0,02 M pH 7,0; a segunda e a terceira eluidas com gradiente linear de tampao fosfato de sodio 0,02 a 0,3 M pH 7,0, em condutancia 0,5 e 0,9 mS, respectivamente. A gel filtracao destas aminopeptidases, em coluna de Bio gel A0,5m equilibrada com tampao fosfato 0,02 M pH 7,0, apresentou, em cada cromatografia, apenas um pico proteico com atividade sobre AA-NA. Eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, em presenca e ausencia de redutor, apresentou apenas uma banda proteica, com peso molecular 70, 78 e 54 k. Da para a primeira, segunda e terceira enzima, respectivamente. A primeira aminopeptidase apresentou valores de KM da ordem de 10-5 M para Ala-, Leu-, Met- e Arg-NA. O melhor substrato, dado pela efiCiência catalitica (Vmax / KM) foi a Met-NA, sendo entao denominada de metionina aminopeptidase (MAP). A MAP de rim de coelho apresentou as seguintes caracteristicas: pH otimo 7,0, inibicao por ions Co2+ e Zn2+, p-OHMB e succinato de hidrocortisona sodica; inibicao parcial por o-PHE e pouco ou nenhuma inibicao pelos ions cloreto, Ca2+, Mg2+ e Mn2+, por EDTA, β-ME, DTT, Leu, Arg, Met, Ala, p-nitroanilina, β-naftilamina, desoxicolato, indometacina , bestatina e puromicina. A segunda aminopeptidase apresentou valores de KM da ordem de 10-5 M para Ala-, Arg-, Leu- e Met-NA. O melhor substrato para essa enzima, dado pela relacao (Vmax / KM) foi a Arg-NA, sendo entao denominada de arginil aminopeptidase (ARG-AP). A Arg-AP de rim de coelho apresentou as seguintes caracteristicas: pH otimo 7,0; ativacao por ions cloreto; inibicao parcial por ions Mn2+ e Zn2+, por succinato de hidrocortisona sodica; inibicao por o-PHE e desoxicolato de sodio; pouco ou nenhuma inibicao por ions Ca2+, Mg2+, EDTA, β-ME, DTT, p-OHMB, Leu, Ala, Arg, Met, p-nitroanilina, β-naftilamina e indometacina. A Arg-NA e inibida competitivamente por bestatina e puromicina, com valores de Ki da ordem de 10-6 e 10 4, respectivamente. A terceira aminopeptidase apresentou valores de KM da ordem de 10-5 M para a Ala-NA e 10-6 M para Arg-, Leu- e Met-NA. Como o melhor substrato, verificado atraves da efiCiência catalitica, foi Leu-NA, a enzima passou a ser chamada de leucil aminopeptidase (LAP). A LAP de rim de coelho tem pH otimo 7,0, sendo inibida parcialmente por ions Zn2+, p-nitroanilina, succinato de hidrocortisona sodica e indometacina; inibida por EDTA, o-PHE, p-OHMB, desoxicolato de sodio. Foi pouco ou nao inibida pelos ions Ca2+, Co2+, Mg2+ e Mn2+, por β-ME, DTT, Leu, Arg, Ala, Met e β-naftilamina. A LAP e inibida competitivamente por bestatina e puromicina com valores de Ki da ordem de 10-7 e 10-6 M, respectivamenteBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe