Transferência do gene bsr [Gene de resistência a blasticidina-s] por meio de vetor retroviral: mutações na região do códon de iniciação levaram a superexpressão

A Introdução de um DNA exogeno em uma celula de mamifero em cultura e a identificacao posterior das celulas transfectadas ou transduzidas, atraves de um marcador seletivo, e um passo fundamental nos protocolos de transferencia genica mediada por retrovirus. A blasticidina-S (BS) e um antibiotico nucleosidico produzido pela Streptomyces griseochromogenes, que inibe especificamente a sintese proteica, tanto em procariotos como em eucariotos. A acao inibitoria da BS pode ser controlada pela blasticidina-S desaminase (bsr), que converte a BS no derivado desaminohidroxila. O gene estrutural do bsr foi isolado do Bacillus cereus cepa K55-S1 e sua ORF e aproximadamente 420pb. Inicialmente, nos demonstramos por meio de vetores retrovirais construidos com o gene bsr (pLBSN e pLNSB),que as celulas transfectadas podem ser selecionadas em 8 dias utilizando 2µg/ml de BS. Ainda que este resultado seja comparavel ao resultado das celulas transfectadas com o gene neo e selecionadas com 500µg/ml de geneticina (G418), nos tentamos aumentar a expressao do gene bsr provocando mutacoes na regiao do codon de iniciacao. Desta forma, teriamos uma selecao rapida utilizando altas concentracoes de BS. Nosso objetivo principal era obter retrovirus recombinantes resistentes a BS para serem usados nos protocolos de terapia genica, porem, com os vetores construidos anteriormente, apenas poucos clones resistentes puderam ser observados. As mutacoes foram introduzidas no gene bsr atraves da tecnica PCR (terminal end PCR mutation technique) e o mutante denominado, bsr1. Os vetores LB1SN e LNSB1, que contem o gene bsr1 sob o controle do promotor e enhancer do retrovirus LTR ou do virus SV40, foram transfectados em celulas NIH3T3 e sua expressao analisada por Northern blot, atividade da enzima BS desaminase e ensaio de formacao de colonias. As celulas transfectadas com LB1SN tiveram que ser selecionadas com 4 ou 8µg/ml de BS contra 2µg/ml para LBSN e pSV2bsr, devido ao rapido crescimento das celulas resistentes. Esta alta resistencia tornou-se compreensivel, ao compararmos os niveis de mRNA transcrito e a atividade enzimatica. A atividade enzimatica aumentou cerca de 4 e 14 vezes comparando-se LB1SN com LBSN e pSV2bsr, respectivamente, sugerindo um maior efeito das mutacoes induzidas no processo de traducao. Quando estes vetores foram transduzidos em das celulas empacotadoras anfotropicas (PA317), somente LB1SN mostrou resistencia contra BS. Consequentemente, as outras linhagens foram selecionadas com geneticina. Os niveis de mRNA do bsr1 nos clones de PA317/LB1SN foram ligeiramente mais elevados do que os de bsr nos clones de PA317/LBSN, o que nao explica a alta resistencia do LB1SN em relacao ao LBSN. Alguns clones de PA317/LB1SN apresentaram alta atividade da BS desaminase (~6000U) e outros, ao redor de 1000U. Curiosamente, alguns clones das celulas selecionadas com geneticina (LBSN, LNSB e LNSB1) tambem mostraram alta atividade enzimatica. Porem, quando os clones celulares com mais de 1000U de atividade enzimatica foram incubados em meio com BS, somente as celulas derivadas de LB1SN cresceram normalmente, e as outras morreram em 5 dias. Deste modo, verificamos que a alta resistencia ao antibiotico BS promovida pelo mutante bsr1 comparado ao bsr, e principalmente ao aumento da biossintese da enzima blasticidina-S desaminase do que da transcricao genicaBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe