Production and characterization of recombinant leptin and TcPTP1, proteins linked to metabolism, cell sinalization and inflamation

Leptin is predominantly secreted by adipocytes and plays an important role in the regulation of the energetic metabolism of mammals. Because of this, leptin is strongly involved in the regulation of obesity. After ligation, dimerization and activation of its specific receptor in the hypothalamus, leptin activates JAK kinases that phosphorylate STAT transcription factors, which in turn up-regulate energetic expenditure and lead to the inhibition of hunger. Leptin signalling is downregulated by a phosphotyrosine phosphatase named PTP1B. The aim of this work is the cloning, expression and purification of recombinant human leptin in E. coli. After induction, recombinant leptin was produced in E.coli BL21(DE3) in an insoluble form, purified by nickel-afinity chromatography, refolded using serial dialysis and concentrated up to 3mg/ml. Injection of this recombinant protein in ob/ob mice, which are devoid of leptin, leads a reduction of body weight by 8% and a reduction of food intake by 50%, thus confirming the biological activity of the protein. In order to enrich this study, we produced a targeted mutation of this recombinant leptin (called mutein) wich act as an antagonist. In other hand, Additionaly to this work, we also cloned, expressed, purified and biochemically characterized a phosphotyrosine phosphatase from Trypanosoma cruzi termed TcPTP1, which is homologous to mammalian PTP1B. TcPTP1 is an interesting medical target because of its potential influence in the regulation of cell signalling in T.cruzi. The production and biochemical characterization of TcPTP1 is the basis for functional and structural studies that can lead to the design of new inhibitors of this enzyme, which seems to be vital for the parasite.A leptina é uma proteína secretada predominantemente por adipócitos com grande importância na regulação do metabolismo energético em mamíferos. Ela está fortemente envolvida na regulação da obesidade. No hipotálamo, após se ligar, dimerizar e ativar o seu receptor específico, a leptina ativa as quinases JAK que fosforilam fatores de transcrição STAT, que por sua vez induzem um aumento do gasto energético e levam a inibição da fome. A sinalização da leptina é regulada negativamente por uma fosfatase de fosfotirosinas denominada PTP1B. O objetivo deste trabalho é a clonagem, expressão e purificação de leptina humana recombinante em bactéria E. coli. Após indução, a leptina recombinante foi produzida em E.coli BL21(DE3) de forma insolúvel, purificada através de cromatografia em coluna de afinidade de níquel, renovelada através de diálise em série e concentrada a 3 mg/ml. A aplicação desta leptina recombinante em camundongos ob/ob com deficiência de leptina, levou os animais a perderem 8% de seu peso corporal e consumirem 50% menos ração em menos de cinco dias, confirmando a atividade biológica da proteína. Acrescentando o estudo, foi produzida uma mutação dirigida desta leptina recombinante (chamada muteína) com propriedade antagonista. Em paralelo a este trabalho, clonamos, expressamos e purificamos a fosfatase de fosfotirosinas TcPTP1 de Trypanosoma cruzi, visando caracterizar bioquimicamente esta proteína e obter mais informação sobre a função deste homólogo de PTP1B em T.cruzi. A enzima TcPTP1 representa um alvo medicinal interessante por causa de sua possível influencia na regulação das vias de sinalização celular de T.cruzi. Portanto a produção recombinante e caracterização bioquímica realizada da TcPTP1 é a base para elucidar a estrutura e função do domínio catalítico que permitirão o desenho de possíveis inibidores contra esta enzima que aparenta ser vital para a sobrevivência do parasita.TEDEBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe