Potencial useful peptides in treatment of breast cancer and the involvement of extracellular matrix componets to trastuzumab resistance

HER2 is a member of epidermal growth factor family of receptors that is an essential mediator of cell proliferation and differentiation. In breast cancer patients, HER2 overexpression is associated with disease aggressiveness, chemo and hormone therapy resistance and poor prognosis. Currently, a HER2 specific monoclonal antibody named trastuzumab, was developed as a treatment for breast cancer; however, there are some reports of resistance to this treatment and it can also cause a high rate of cardiac failure, despite the high cost. The aim of the present study was select specific peptides target to recombinant HER2 protein using a phage display technology. The selected cyclic peptides, called Hercid and Tavelorb, were chemically synthesized. The bacteriophages expressing the specific peptides selected, as well as the synthetic peptides were assayed using different breast cancer cell lines compared to the trastuzumab. Cellular viability, migration and apoptosis/necrosis were evaluated. The results showed that the peptides were able to reduce the cell viability around 50% alone and 85% in association. Tavelorb was able to induce apoptosis/ necrosis in 70% of SKBR3 cells and when associated with Hercid, the effect has increased to 90%. This association decreases tumor cells migration around 85%. The HER2 binding assays showed that the peptides compete with trastuzumab. These peptides co-localize with acidic vesicles around 40-50%, suggesting a possible endocytosis induction and HER2 degradation. The peptides and trastuzumab co-localized with heparan sulfate around 70% suggesting that the binding of these molecules and heparan sulfate could play an important role in antitumoral activity over breast cancer cells. The data propose a potential use of these peptides as an alternative for breast cancer treatment. In addition, we analyzed whether some extracellular matrix components influence trastuzumab treatment. Heparanase-1 (HPSE-1) overexpression effect was analyzed using MCF7 cells stable transfected with HPSE-1 cDNA (MCF7-HPSE-1). The glycosaminoglycans profile, HPSE-1, HPSE-2, Syndecan-1 (Syn-1) and HER2 mRNA expression, HPSE- 1 activity and cell viability were evaluated in different breast cancer cells treated or not with trastuzumab. MCF7-HPSE-1 becomes completely resistant to trastuzumab. HPSE-1 transfection changes the galactosaminoglycans profile of MCF7. Trastuzumab co-localizes in high levels with heparan sulfate (HS) and their binding is necessary to antibody activity. In MCF7 cells, trastuzumab decreases HPSE-1, HPSE-2, HER2 and Syn-1 mRNA expression, while in MCF7-HPSE-1 the antibody increases the mRNA expression of these molecules. SKBR3 cells have the highest expression levels of these molecules, but low HPSE-1 activity, which seems to be determinant to trastuzumab response and modulated by HPSE-2. Our results have demonstrated that an ideal concentration of HS in cell surface and medium, regulated by trastuzumab, is necessary to its action. Secreted HS can sequester trastuzumab, decreasing the antibody amount disposable to interact with HER2 in cell surface. HS secreted could also block HPSE-2, which will not be able to inhibit HPSE-1 activity, contributing for tumor resistance to trastuzumab and supporting tumoral progression. In addition, as the relation HPSE-1/HER2 expression decreases, breast cancer cells sensibility to trastuzumab also decreases. These new insights could be useful when devising strategies for overcoming trastuzumab resistance in HER2 positive cancers.O HER2 é um dos membros da família de receptores do fator de crescimento epidérmico capaz de promover a proliferação e diferenciação celular. Em pacientes com câncer de mama, a superexpressão de HER2 está associada com a agressividade da doença, resistência à quimioterapia e hormonioterapia e prognóstico desfavorável. Atualmente foi desenvolvido um anticorpo monoclonal específico contra o receptor HER2, denominado trastuzumab, no entanto, existem relatos de resistência dos tumores de mama ao tratamento com tal anticorpo e alta taxa de falência cardíaca como reação adversa, além do alto custo. O objetivo desta tese foi selecionar peptídeos específicos ligantes da proteína HER2 recombinante utilizando a tecnologia de “Phage Display”. Os peptídeos cíclicos selecionados, denominados Hercid e Tavelorb, foram quimicamente sintetizados. Os bacteriófagos expressando os peptídeos específicos selecionados, bem como os peptídeos sintéticos foram testados, em comparação com trastuzumab, em diferentes linhagens celulares tumorais de mama. O efeito foi avaliado em ensaios de viabilidade, migração e apoptose/necrose celular. Os resultados demonstraram que os peptídeos Hercid e Tavelorb foram capazes de reduzir a viabilidade de células SKBR3 em 50% isoladamente e 85% quando utilizados em associação. O peptídeo Tavelorb foi capaz de induzir a apoptose / necrose em 70% das células SKBR3 e, quando associado com Hercid, o efeito aumenta para 90%. Esta associação também promove redução da migração das células tumorais em 85%. Os ensaios de ligação ao receptor HER2 mostraram que ocorre competição entre os peptídeos selecionados e trastuzumab. Estes peptídeos co-localizam com vesículas ácidas em 40-50%, sugerindo possível indução de endocitose e destruição de HER2, além de co-localizarem com heparam sulfato em torno de 70%, sugerindo que a interação entre estas moléculas poderia desempenhar um papel importante na atividade antitumoral mediada por tais peptídeos e pelo trastuzumab. Os dados apresentados propõem o uso desses peptídeos como uma potencial alternativa para o tratamento do câncer de mama. Além disso, foi analisada a influência de alguns componentes da matriz extracelular no tratamento com trastuzumab. O efeito da superexpressão da Heparanase-1 (HPSE-1) foi avaliado utilizando células MCF-7 estavelmente transfectadas com o cDNA da HPSE-1 (MCF7-HPSE-1). Foram analisados o perfil e quantidade de glicosaminoglicanos, a expressão do RNAm da HPSE-1, HPSE-2, Sindecam-1 (Syn-1) e HER2, a atividade da HPSE-1 e a viabilidade celular em diferentes linhagens de de mama, tratadas ou não com trastuzumab. As células MCF7-HPSE-1 tornaram-se completamente resistentes ao tratamento com trastuzumab. A transfecção com HPSE-1 também alterou o perfil de galactosaminoglicanos desta célula. O anticorpo trastuzumab co-localiza com heparam sulfato (HS) e esta ligação é necessária para a atividade antitumoral do anticorpo. Em células MCF7, trastuzumab diminui a expressão do RNAm de HPSE- 1, HPSE-2, HER2 and Syn-1, enquanto nas células MCF7-HPSE-1 o anticorpo aumenta a expressão do RNAm de tais moléculas. As células SKBR3 possuem os níveis mais altos de expressão destas moléculas porém, apresentam menor atividade da HPSE-1, modulada pela HPSE-2, o que parece ser determinante para a resposta ao trastuzumab. Os resultados demonstraram que uma concentração ideal de HS na superfície celular e meio, regulada por trastuzumab, é necessária para sua ação. O HS secretado para o meio pode sequestrar o trastuzumab, diminuindo a quantidade do anticorpo disponível para interagir com o HER2 na superfície celular. O HS do meio pode bloquear a HPSE-2, a qual deixaria de inibir a atividade da HPSE-1 contribuindo para a resistência do tumor ao trastuzumab e favorecendo a progressão tumoral. Além disso, com a redução da relação HPSE-1/HER2 a sensibilidade das células de câncer de mama ao trastuzumab também diminui. Esses novas perspectivas poderia ser úteis no desenvolvimento de estratégias de superação da resistência dos tumores HER2 positivos ao trastuzumab.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Núcleo de Ensino, Pesquisa e Assessoria à Saúde (NEPAS)TEDEBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe