Role of renin angiotensin system on cardiovascular changes in experimental diabetes in vivo and in vitro evaluation

The aim of the present study was to elucidate the role of renin angiotensin system, by “in vivo” and “in vitro” evaluation, on cardiac dysfunction induced by streptozotocin experimental diabetes. Male Wistar rats (250-300g) were divided in 4 groups: control (n=9), control + Enalapril, (n=7, 1mg/Kg), diabetic (n=7, STZ, 50mg/Kg ev), and diabetic + Enalapril (n=7). In vivo studies included: echocardiography as a non invasive tool for ventricular function evaluation and catheterization of left ventricle (LV) to evaluate invasively. The last one was performed in basal condition and after a volume overload protocol. Arterial pressure (AP) was measured directly in awake animals. Biochemistry dosage included angiotensin converting enzyme (ACE) activity in serum, heart and primary cardiac fibroblast culture treated with glucose (25 mM). Diabetes induced hyperglicemia and progressive body weight loss during the protocol. These alterations were not attenuated by enalapril treatment. There were impairment on morphometric (increased LV cavity, reduced intraventricular septum thickness and LV posterior wall thickness) and contractile function parameters (reduced ejection fraction and velocity of circumferential shortening; increased mean E peak velocity, E wave desacceleration time and isovolumetric relaxation time) in the diabetic animalshearts (15 and 30 days). Enalapril treatment attenuated these impairments. In the invasive LF evaluation (30 days), in the basal period, diabetic group presented diminished LV systolic pressure (control: 134 ± 13 vs diabetic 113 ± 14 mmHg*) and LV contractility, measured by +dP/dt (control: 9229 ± 1225 vs diabetic: 6565 ± 1610 mmHg/seg*) and by -dP/dt (control: - 6845± 1002 vs diabetic: - 4745 ± 1557 mmHg/seg*), and also enhanced LV end diastolic pressure (EDP) (control: 4,98 ± 0,98 vs diabetic: 7,36 ± 0,5 mmHg*) as compared to control group. Enalapril treatment did not modify these LV functional parameters in the basal period. Furthermore, the differences observed between control and diabetic groups were maintained after the volume overload protocol. However, enalapril treated diabetic animals presented LV diastolic function parameters (PDF e –dP/dt) after the volume overload similar to their resting values. Differently, the diabetic group showed twice PDF values after volume overload in comparison to it basal PDF values. Direct AP signals measurements (Windaq, 2KHz) in awake animals evidenced hypotension and bradycardia in diabetic groups, treated or not with enalapril, when compared to control groups. Diabetic animals’ serum ACE activity using ZPhe-HHL substrate was 50% increased when compared to control animals; however, enalapril treatment did not inhibit this activity. The opposite was observed in heart tissue: ACE activity reduced 25% in diabetic group and control treated group did not present ACE inhibition in relation to control group. Enalapril treated diabetic group showed ~50% ACE (substrate ZPhe-HHL) inhibition in comparison to treated or untreated control groups. Similar profile was evidenced with ACE substrate HHL in serum and heart. However, it was observed higher ACE substrate ZPhe activation, in both, serum and heart, in comparison to ACE substrate His Leu. Heart ACE protein expression by “western blotting” was increased in diabeticgroups (treated and untreated) in relation to control group with two antibodies: high molecular weight (136KDa) and low molecular weight (69KDa). The increased ACE protein expression was accompanied by heart reduced ACE activity. Glucose treatment increased ~85% ACE activity in primary cardiac fibroblast cultures. In conclusion, streptozotocin experimental diabetes induced impairment in morphometric cardiac parameters and in systolic and diastolic function. Similar condition has been reported in humans. Despite of enalapril therapeutic intervation, in 15 and 30 days, had attenuted these dysfunctions in diabetics, it did not induce AP or heart rate normalization. The inhibition of LV function impairments by enalapril treatment suggests that renin angiotensin system activation plays an important role in the diabetic cardiovascular dysfunctions .O objetivo do presente estudo foi avaliar a participação do sistema renina angiotensina através de avaliações “ in vivo” e “in vitro” na disfunção cardíaca induzida pelo diabetes experimental por estreptozotocina. Foram utilizados ratos Wistar machos (250-300g) divididos em 4 grupos: Controle Saudável (n=9), Controle Enalapril, (n=7, 1m/Kg), Diabético (n=7, STZ, 50mg/Kg ev), e Diabético + Enalapril (n=7). Nos estudos “in vivo” foi avaliada a função ventricular de forma não invasiva pelo ecocardiograma e invasiva pela cateterização do ventrículo esquerdo (VE) no período basal e após sobrecarga de volume e a pressão arterial (PA) de forma direta nos animais acordados. As dosagens bioquímicas incluíram medida da enzima de conversão da angiotensina (ECA) no soro e coração dos ratos, e em cultura primária de fibroblastos cardíacos tratados com glicose no meio de cultura (25 mM). O diabetes induziu perda de peso corporal gradativa ao longo das 4 semanas e hiperglicemia, alterações que não foram atenuadas pelo tratamento com enalapril. Observou-se prejuízo em parâmetros morfométricos (aumento da cavidade do VE, diminuição da espessura do septo intraventricular e da parede posterior do VE) e de função contrátil (redução da fração de ejeção e da velocidade de encurtamento circunferencial; aumento da velocidade média do picoE, do tempo de desaceleração da onda E e do tempo de relaxamento isovolumétrico) no coração dos animais diabéticos (15 e 30 dias). O tratamento com enalapril atenuou tais prejuízos. Na análise funcional invasiva do VE em 30 dias, no período basal, o grupo diabético apresentou redução da pressão sistólica do VE (controle: 134 ± 13 vs diabético 113 ± 14 mmHg*) e da contratilidade do VE, avaliada pela +dP/dt (controle: 9229 ± 1225 vs diabético: 6565 ± 1610 mmHg/seg *) e pela - dP/dt (controle: - 6845± 1002 vs diabético: - 4745 ± 1557 mmHg/seg*), além de aumento da pressão diastólica final do VE (PDF) (controle: 4,98 ± 0,98 vs diabético: 7,36 ± 0,5 mmHg*) quando comparados ao grupo controle. O tratamento com enalapril não modificou esses parâmetros de função do VE no período basal. Além disto, as diferenças observadas entre o grupo controle e o grupo diabético foram mantidas após um protocolo de sobrecarga de volume. Entretanto, os animais diabéticos tratados com enalapril após a sobrecarga de volume apresentaram medidas de função diástólica do VE (PDF e –dP/dt) semelhantes aos valores do período basal, diferentemente do grupo diabético, no qual, ao final do protocolo de sobrecarga, observou-se valores dobrados de PDF em relação ao período basal. A análise direta dos sinais de PA (Windaq, 2KHz) nos animais acordados evidenciou hipotensão e bradicardia nos grupos diabéticos, tratados ou não com enalapril, em relação aos grupos controles. No soro dos animais diabéticos a atividade da ECA utilizando o substrato ZPhe-HHL aumentou em torno de 50% em relação aos animais controles, no entanto, o tratamento com enalapril não inibiu essa atividade. O oposto foi observado no tecido cardíaco: no grupo diabético a atividade da ECA reduziu em torno de 25%, enquanto, o controle tratado não teve inibição da ECA quando comparados ao controle. O grupo diabético tratado com enalapril obteve uma inibição da ECA em torno de 50%(substrato ZPhe-HHL) em relação aos controles tratados ou não. O mesmo perfil foi observado com o substrato HHL no soro e coração. Entretanto, observou-se uma ativação maior da ECA pelo substrato ZPhe, tanto no soro como no coração em relação ao substrato His Leu. Na análise da expressão proteica da ECA por “western blotting” no coração observou-se uma expressão protéica da ECA aumentada nos animais diabéticos e diabéticos tratados em relação aos controles com os dois anticorpos utilizados: alto peso molecular (136KDa) e de baixo peso (69KDa). Os resultados de expressão protéica aumentada da ECA, foram acompanhados de redução da atividade da enzima no tecido cardíaco. A atividade bioquímica da ECA analisada em cultura de fibroblastos cardíacos estava aumentada em torno de 85% após tratamento com glicose. Concluí-se que o diabetes experimental por estreptozotocina induziu prejuízo em parâmetros cardíacos morfométricos e de função sistólica e diastólica de forma semelhante ao que vem sendo documentado em humanos. Porém a intervenção terapêutica com enalapril tanto em 15 quanto em 30 dias de diabetes atenuou essas disfunções sem, no entanto, promover normlaização da PA e frequência cardíaca. O fato da prejuízo da função do VE observada nos animais diabéticos ter sido inibida pelo tratamento com enalapril sugere que a ativação do sistema renina angiotensina tem um papel importante nas disfunções cardiovasculares do diabetes.TEDEBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe