Celular and molecular mechanisms of androgen deprivation-induced skeletal muscle atrophy

Skeletal muscle fibers are multinucleated cells and each myonucleus controls gene expression in a defined cytoplasmic region, the nuclear domain (ND). Generally, muscle atrophy occurs with increased proteolysis by expression of specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1, thus leading to loss of cytoplasm and ND remodeling. The neuromuscular junction (NMJ) is also remodeled by reduced functional load in the atrophied fiber. The levator ani muscle (LA) of the adult male rat is highly sensitive to androgens and atrophies with castration. Therefore, we investigated the effect of androgen deprivation on LA atrogin-1 expression, ND organization and NMJ remodeling. Fibers from LA or extensor digitorum longus muscle (EDL) were isolated from 4-month-old male Wistar rats, both normal controls or after castration for 2 to 90 days. Fibers were used for histochemical staining of acetylcholinesterase (AChE) or histofluorescent staining of nicotinic cholinoceptors (nAChR) and nuclei. Brightfield images or confocal z-series were acquired and fiber diameter, ND size, NMJ length and volume were measured. Atrogin-1 expression was evaluated by qRT-PCR and immunoblotting, and caspase 3 activity was assessed by a fluorimetric assay with Ac-DEVD-AMC substrate. Castration induced atrophy of LA, which reached 30% of control weight after 90 days. Atrogin-1 mRNA increased 31-fold after 2-day castration, returning to normal levels after 30 days, while atrogin-1 protein increased linearly up to 270% of control values after 30 days. Testosterone propionate treatment (4 mg/kg, sc) for just 24 h reduced atrogin-1 mRNA to control levels. Fiber diameter and nuclear domains decreased to 39% and 24% of control values after 60-day castration, respectively. Interestingly, castration did not change caspase 3 activity in LA. Castration progressively reduced NMJ length and volume to 65% and 54% of normal values after 90 days, respectively. No changes were seen in EDL up to 90-day castration. Castration-induced LA atrophy is accompanied by increased atrogin-1 and apoptosis throughout the fiber, without global caspase 3 activity increase. However, loss of nuclei is not enough to maintain cytoplasm/nucleus ratio (ND) in the atrophied fiber. LA atrophy occurs with NMJ shrinkage in length and volume, indicating a passive response of junctional ND to loss of cell volume and surface.A fibra muscular esquelética é uma célula multinucleada, onde cada núcleo controla uma região citoplasmática definida, o domínio nuclear (DN). Em geral, a atrofia muscular ocorre com aumento da proteólise por expressão de ubiquitina ligases específicas, como atrogin-1, com perda de citoplasma e remodelagem dos DN, que explicariam a perda de massa muscular. A junção neuromuscular (JNM) também é remodelada frente à redução da demanda funcional na fibra atrofiada. Para estudar o efeito de andrógenos no trofismo muscular, utilizamos como modelo o músculo elevador do ânus (EA) do rato adulto, estrutura altamente sensível à testosterona que atrofia com a castração. Assim, investigamos o efeito da privação de andrógeno na expressão de atrogin-1, organização dos DN e remodelagem da JNM no EA. Fibras do EA ou do músculo extensor longo dos dedos (EDL) de ratos Wistar de 4 meses, normais (N) ou castrados por 2 a 90 dias foram submetidas à marcação histoquímica para acetilcolinesterase (AChE) e por histofluorescência para o receptor colinoceptivo nicotínico (nAChR) e núcleos. Imagens de campo claro ou séries z em microscopia confocal foram adquiridas para a medição do diâmetro das fibras, tamanho dos DN, comprimento e volume da JNM. A expressão de atrogin-1 foi analisada por qRT-PCR e immunoblotting e a atividade da caspase 3, por um ensaio fluorimétrico com o substrato Ac-DEVD-AMC. A castração induziu atrofia do EA, até 30% do peso N após 90 dias. O RNAm de atrogin-1 aumentou 31 vezes após castração por 2 dias, retornando ao nível normal após 30 dias, enquanto a proteína atrogin-1 aumentou linearmente até 270% do valor N após 30 dias. A administração de propionato de testosterona (4 mg/kg, s.c.) por apenas 24 h reduziu o RNAm de atrogin-1 ao nível N. O diâmetro das fibras e os domínios nucleares foram reduzidos a 39% e 25% do valor N após 60 dias de castração, respectivamente. Interessantemente, a castração não mudou a atividade da caspase 3 no EA. O comprimento e o volume da JNM diminuíram progressivamente, até 65% e 54% dos valores N em 90 dias, respectivamente. Nenhuma mudança foi observada no EDL com a castração por até 90 dias. Nossos resultados mostraram que a atrofia do EA induzida pela castração é acompanhada por expressão aumentada de atrogin-1 e apoptose no decorrer da fibra, sem aumento global da atividade da caspase 3. Entretanto, essa perda de núcleos não é suficiente para manter a relação citoplasma/núcleo (DN) na fibra atrofiada. O encolhimento da JNM em comprimento e volume acompanha a atrofia do EA, indicando uma resposta passiva dos DN juncionais à perda de volume e diminuição da superfície celular.TEDEBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe